DE-102019203923-B4 - Verfahren zur Lokalisierung von Signalquellen in der Lokalisierungsmikroskopie

Abstract

Verfahren in der Lokalisierungsmikroskopie zur Lokalisierung von Signalquellen (3.1, 3.2), bei dem - mindestens einmal für jedes Pixel (1) eines zur Erfassung von Detektionsstrahlung verwendeten Detektors (2) Werte eines pixelspezifischen Fehlerparameters ermittelt und dem betreffenden Pixel (1) zugeordnet in einem Kalibrierdatensatz gespeichert werden; - Bilddaten einer Probe pixelweise als Pixelwerte erfasst und in einem Bilddatensatz gespeichert werden; - anhand der erfassten Bilddaten eine Anzahl von Pixel (1) umfassende Ursprungsbereiche (4) von Signalquellen (3.1,3.2) identifiziert werden; - eine Punktverteilungsfunktion an die Pixelwerte der jeweiligen Ursprungsbereiche (4) angepasst wird; und - anhand der Punktverteilungsfunktion eine Lokalisierung der jeweiligen Signalquelle (3.1, 3.2) innerhalb des betreffenden Ursprungsbereichs (4) erfolgt; dadurch gekennzeichnet, dass - für jedes Pixel (1) der pixelspezifische Fehlerparameter mit einem Schwellwert verglichen wird; - jedes Pixel (1), das einen Wert des pixelspezifischen Fehlerparameters größer als der Schwellwert aufweist, in dem Kalibrierdatensatz markiert wird; und - bei der Anpassung der Punktverteilungsfunktion markierte Pixel (1) in dem Bilddatensatz entweder ignoriert oder mittels Interpolation ersetzt werden.

Inventors

• Thomas KALKBRENNER
• Yauheni Novikau
• Martin Beck

Assignees

• CARL ZEISS MICROSCOPY GMBH

Dates

Publication Date

20260507

Application Date

20190322

Claims (7)

1. Verfahren in der Lokalisierungsmikroskopie zur Lokalisierung von Signalquellen (3.1, 3.2), bei dem - mindestens einmal für jedes Pixel (1) eines zur Erfassung von Detektionsstrahlung verwendeten Detektors (2) Werte eines pixelspezifischen Fehlerparameters ermittelt und dem betreffenden Pixel (1) zugeordnet in einem Kalibrierdatensatz gespeichert werden; - Bilddaten einer Probe pixelweise als Pixelwerte erfasst und in einem Bilddatensatz gespeichert werden; - anhand der erfassten Bilddaten eine Anzahl von Pixel (1) umfassende Ursprungsbereiche (4) von Signalquellen (3.1,3.2) identifiziert werden; - eine Punktverteilungsfunktion an die Pixelwerte der jeweiligen Ursprungsbereiche (4) angepasst wird; und - anhand der Punktverteilungsfunktion eine Lokalisierung der jeweiligen Signalquelle (3.1, 3.2) innerhalb des betreffenden Ursprungsbereichs (4) erfolgt; dadurch gekennzeichnet , dass - für jedes Pixel (1) der pixelspezifische Fehlerparameter mit einem Schwellwert verglichen wird; - jedes Pixel (1), das einen Wert des pixelspezifischen Fehlerparameters größer als der Schwellwert aufweist, in dem Kalibrierdatensatz markiert wird; und - bei der Anpassung der Punktverteilungsfunktion markierte Pixel (1) in dem Bilddatensatz entweder ignoriert oder mittels Interpolation ersetzt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet , dass der Schwellwert in Abhängigkeit von Wellenlängen einer Detektionsstrahlung, einer Intensität der Detektionsstrahlung und/oder einer Temperatur des Detektors (2) festgelegt wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2 , dadurch gekennzeichnet , dass im Mittel je Ursprungsbereich (4) eine vorbestimmte Höchstzahl an Pixeln (1) markiert wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , dass die Pixelwerte der nicht markierten Pixel (1) unter Nutzung des Kalibrierdatensatzes korrigiert werden.
5. Verfahren in der Lokalisierungsmikroskopie zur Lokalisierung von Signalquellen (3.1, 3.2), bei dem - mindestens einmal für jedes Pixel (1) eines zur Erfassung von Detektionsstrahlung verwendeten Detektors (2) Werte eines pixelspezifischen Fehlerparameters ermittelt und dem betreffenden Pixel (1) zugeordnet in einem Kalibrierdatensatz gespeichert werden; - Bilddaten einer Probe pixelweise als Pixelwerte erfasst in einem Bilddatensatz gespeichert werden; - anhand der erfassten Bilddaten eine Anzahl von Pixel (1) umfassende Ursprungsbereiche (4) von Signalquellen (3.1, 3.2) identifiziert werden; - eine Punktverteilungsfunktion an die Pixelwerte der jeweiligen Ursprungsbereiche (4) angepasst wird; und - anhand der Punktverteilungsfunktion eine Lokalisierung der jeweiligen Signalquelle (3.1, 3.2) innerhalb des betreffenden Ursprungsbereichs erfolgt; dadurch gekennzeichnet , dass - anhand des Kalibrierdatensatzes für jedes Pixel (1) ein abgeleiteter Fehlerparameter ermittelt und/oder ein ADU-Histogramm einer Anzahl von Pixelwerten erstellt wird; und - der abgeleitete Fehlerparameter und/oder das ADU-Histogramm in dem Kalibrierdatensatz den jeweiligen Pixeln (1) zugeordnet abgespeichert werden; - die Anpassung der Punktverteilungsfunktion anhand des abgeleiteten Fehlerparameters beziehungsweise anhand der jeweiligen ADU-Histogramme erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 5 , dadurch gekennzeichnet , dass als abgeleiteter pixelspezifischer Fehlerparameter eine Varianz der Pixelwerte einer Zeitserie, eine Varianz der Pixelwerte einer Zeitserie bei jeweils unterschiedlichen Beleuchtungsstärken und/oder Mittelwerte je einer Zeitserie bei jeweils unterschiedlichen Beleuchtungsstärken ermittelt werden.
7. Verfahren nach Anspruch 6 , dadurch gekennzeichnet , dass anhand der Varianzen aus den Zeitserien unterschiedlicher Beleuchtungsstärken und den Mittelwerten eine Photonen-Transfer-Kurve für jedes Pixel (1) ermittelt und als abgeleiteter pixelspezifischer Fehlerparameter verwendet wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Hauptanspruchs. Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Verfahren der Lokalisierungsmikroskopie bekannt. Prominente Beispiele sind Verfahren zur Lokalisierung einzelner Signalquellen, insbesondere einzelner Emitter, nach den mit den Abkürzungen „PALM“ (photoactivated localization microscopy; z. B. WO 2006/127692 A2) beziehungsweise „STORM“ (stochastical optical reconstruction microscopy; US 2008/0032414 A1) bezeichneten Verfahren. Eine Übersicht zur Lokalisierungsmikroskopie findet sich beispielsweise in den Artikeln von Klein et al., 2014 (Klein, T. et al., 2014; Eight years of single molecule localization microscopy. Histochemistry and cell biology 141: 561 - 575) und Babcock et al. 2012) (Babcock, H. et al., 2012; A high-density 3D localization algorithm for stochastical optical reconstruction microscopy. Optical Nanoscopy 1: 6). Den bekannten Verfahren der Lokalisationsmikroskopie ist gemein, dass sie die Information zur Lokalisierung der Signalquellen (Emitter, emittierende Moleküle) von pixelierten 2D-Flächensensoren gewinnen, die als Detektor beziehungsweise als Kamera dienen. Da für die Lokalisation einzelner Signalquellen wie einzelner emittierender Moleküle nur einige 100 bis wenige 1000 Photonen je Lokalisationsschritt zur Verfügung stehen, sind sehr empfindliche Detektoren erforderlich. Solche empfindlichen Detektoren sind beispielsweise EMCCD-Sensoren (electron multiplying charge coupled device). Die den EMCCD-Sensoren zu Grunde liegende CCD-Architektur mit seriellen Auslese- und Verstärkungsprozessen bedingt jedoch limitierte Pixelzahlen und/oder begrenzte Auslesegeschwindigkeiten. Als Alternative haben sich in den letzten Jahren die sogenannten „scientific CMOS“ oder sCMOS Sensoren etabliert (CMOS = complementary metal oxide sensor). Sie vereinen die durch die CMOS-Technologie mögliche „Active Pixel Sensor“-Architektur mit sehr geringem Ausleserauschen und hohen Quanteneffizienzen. Die Vorteile der sCMOS-Sensoren gegenüber den gängigen EMCCD-Kameras bestehen beispielsweise in hohen Frameraten, einer großen Pixelanzahl und kleineren Pixeln. Außerdem tritt kein sogenanntes Excess-Noise auf, da in den sCMOS-Sensoren keine Elektronenvervielfachung erfolgt. Letztlich führt dies zu einer höheren effektiven Quanteneffizienz. Die sCMOS-Sensoren bieten sich daher für den Einsatz auch bei der Lokalisierungsmikroskopie an. Nachteilig für die Genauigkeit der Lokalisation einzelner Emitter als Strahlungsquellen sind dabei mögliche Inhomogenitäten im Signalverhalten der einzelnen Pixel. Während bei normaler Bildgebung solche Signalinhomogenitäten schlimmstenfalls zu einem gestörten Bildeindruck führen, können sie beim Lokalisierungsschritt in der Lokalisierungsmikroskopie eine gerichtete Fehllokalisierung verursachen. Derartige Inhomogenitäten können insbesondere durch die bereits erwähnte „Active Pixel Sensor“-Architektur bedingt sein. Die Patentschrift US 9,769,399 B2 sowie der Fachbeitrag von Huang et. al, 2013 (Huang, F. et al., 2013; Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single molecule localization algorithms. Nature methods 10: 653-658) beschreiben die Nutzung parametrisierter Modelle, um das Rauschverhalten zu modellieren. Dabei wird ein pixelabhängiges Rauschen als Gaußverteilung modelliert. Parameter der Modellierung sind beispielsweise der Mittelwert der Gaußverteilung (Offset), die Varianz der Verteilung und/oder der Verstärkungsfaktor (Gain) je Pixel. Ein Offset kann zum Beispiel ermittelt werden, indem eine Anzahl von Dunkelbildern erfasst wird. Anhand dieser Dunkelbilder können Signale ermittelt werden, die von dem Pixel trotz eines Fehlens einer Detektionsstrahlung erzeugt wurden (Dunkelrauschen; fehlerhafte Signale). Aus diesen Daten kann beispielsweise ein Mittelwert gebildet und als Fehlerparameter verwendet werden. Der Gain kann ermittelt werden, indem eine Anzahl von Bildern bei unterschiedlichen, jedoch bekannten Photonenzahlen beziehungsweise Beleuchtungsstärken erfasst und ausgewertet werden. Ausgehend von den erfassten Bilddaten kann eine Verteilungsfunktion der Pixelwerte je Pixel ermittelt werden, bei der beispielsweise die Summe der Photon-induzierten Varianz („Schrotrauschen“) und gaußscher Varianz genutzt werden. Nachteilig an einem solchen Ansatz zur Korrektur des Rauschverhaltens ist jedoch, dass einzelne Pixel, die signifikant von dem jeweiligen Modell abweichen, zu erheblichen Fehlern führen können. Als Beispiel für solche Pixel seien sogenannte „Blinker“ angeführt, die zu zufällig ausgegebenen Signalen führen können (Wang, X. et al. 2006; Random telegraph signals in CMOS image sensor pixels. Electron Devices Meeting; IEDM'06, International IEEE 2006). Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein Verfahren in der Lokalisierungsmikroskopie zur Lokalisierung von Signalquellen vorzuschlagen, mit dem die im Stand der Technik auftretenden Nachteile reduziert werden. Die Aufgabe wird mit einem Verfahre