DE-102025101783-B3 - VERFAHREN, VORRICHTUNG UND LICHTMIKROSKOP ZUR ZEITAUFGELÖSTEN EINZELPHOTONENMESSUNG

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur zeitaufgelösten Einzelphotonenmessung, wobei von einer Lichtquelle (3) Lichtpulse (L) erzeugt werden, wobei aufgrund der Lichtpulse (L) von einer Probe (2) emittierte Photonen (P) von einem Detektor (4) erfasst werden und von einer mit dem Detektor (4) gekoppelten Auswertevorrichtung (5) registriert werden, wobei von der Auswertevorrichtung (5) Erfassungszeitpunkte (t P ) der Photonen (P) bestimmt werden, wobei von der Auswertevorrichtung (5) durch Auswertung eines Signals der Lichtquelle (3) oder eines Sensors (11) periodisch Pulszeitpunkte (t L ) eines Teils der Lichtpulse (L) bestimmt werden, wobei die Pulszeitpunkte (t L ) mit einer geringeren Rate bestimmt werden als eine Repetitionsrate der Lichtpulse (L), wobei auf Basis der bestimmten Pulszeitpunkte (t L ) Pulszeitpunkte (t L ') weiterer Lichtpulse (L) geschätzt werden, und wobei die Pulszeitpunkte (t L , t L ') als Referenzzeitpunkte für die Erfassungszeitpunkte (t P ) der Photonen (P) verwendet werden sowie eine Vorrichtung (1) zur Einzelphotonenmessung, ein Lichtmikroskop (10) mit der Vorrichtung (1) und ein Computerprogramm.

Inventors

• Andreas SCHÖNLE

Assignees

• ABBERIOR INSTRUMENTS GMBH

Dates

Publication Date

20260507

Application Date

20250120

Claims (13)

1. Verfahren zur zeitaufgelösten Einzelphotonenmessung, wobei von einer Lichtquelle (3) Lichtpulse (L) erzeugt werden, wobei aufgrund der Lichtpulse (L) von einer Probe (2) emittierte Photonen (P) von einem Detektor (4) erfasst werden und von einer mit dem Detektor (4) gekoppelten Auswertevorrichtung (5) registriert werden, wobei von der Auswertevorrichtung (5) Erfassungszeitpunkte (t P ) der Photonen (P) bestimmt werden, dadurch gekennzeichnet , dass von der Auswertevorrichtung (5) durch Auswertung eines Signals der Lichtquelle (3) oder eines Sensors (11) periodisch Pulszeitpunkte (t L ) eines Teils der Lichtpulse (L) bestimmt werden, wobei die Pulszeitpunkte (t L ) mit einer geringeren Rate bestimmt werden als eine Repetitionsrate der Lichtpulse (L), wobei auf Basis der bestimmten Pulszeitpunkte (t L ) Pulszeitpunkte (t L ') weiterer Lichtpulse (L) geschätzt werden, und wobei die Pulszeitpunkte (t L , t L ') als Referenzzeitpunkte für die Erfassungszeitpunkte (t P ) der Photonen (P) verwendet werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet , dass nur die geschätzten Pulszeitpunkte (t L ') als Referenzzeitpunkte für die Erfassungszeitpunkte (t P ) der Photonen (P) verwendet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2 , dadurch gekennzeichnet , dass für jeden Erfassungszeitpunkt (t P ) eines Photons (P) mindestens ein vorhergehender Pulszeitpunkt (t L ') und mindestens ein nachfolgender Pulszeitpunkt (t L ') geschätzt wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , dass die Auswertevorrichtung (5) Datenkanäle (52) und eine Schaltvorrichtung (50) aufweist, wobei mit der Schaltvorrichtung (50) Ausgangssignale des Detektors (4) und der Lichtquelle (3) oder des Sensors (11) auf die Datenkanäle (52) verteilt werden, wobei von der Auswertevorrichtung (5) unter Verwendung der Datenkanäle (52) Erfassungszeitpunkte (t P ) von Photonen (P) und Pulszeitpunkte (t L ) der Lichtpulse (L) bestimmt werden.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , dass von der Auswertevorrichtung (5) auf Basis der bestimmten Pulszeitpunkte (t L ) eine Zeitreihe der geschätzten Pulszeitpunkte (t L ') erstellt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5 , dadurch gekennzeichnet , dass die Pulszeitpunkte (t L , t L ') als Referenzzeitpunkte für die Erfassungszeitpunkte (t P ) der Photonen (P) verwendet werden, indem für die Erfassungszeitpunkte (t P ) der Photonen (P) jeweilige Perioden und Phasen der Zeitreihe bestimmt werden.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , dass die Rate der Bestimmung der Pulszeitpunkte (t L ) 20 % der Repetitionsrate oder weniger, insbesondere 10 % der Repetitionsrate oder weniger, weiter insbesondere 5 % der Repetitionsrate oder weniger, beträgt.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , dass von der Lichtquelle (3) oder von der Lichtquelle (3) und einer weiteren Lichtquelle erste Lichtpulse (L1) und zweite Lichtpulse (L2) unterschiedlicher Farbe erzeugt werden, wobei die ersten Lichtpulse (L1) und die zweiten Lichtpulse (L2) zeitlich zueinander versetzt sind, wobei aufgrund der ersten Lichtpulse (L1) von der Probe (2) emittierte Photonen (P1) und aufgrund der zweiten Lichtpulse (L2) von der Probe (2) emittierte Photonen (P2) von dem Detektor (4) oder von dem Detektor (4) und einem weiteren Detektor erfasst werden, wobei von der Auswertevorrichtung (5) durch Auswertung des Signals zumindest Pulszeitpunkte (t L ) eines Teils der ersten Lichtpulse (L1) und/oder eines Teils der zweiten Lichtpulse (L2) bestimmt werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8 , dadurch gekennzeichnet , dass Pulszeitpunkte (t L ) der zweiten Lichtpulse (L2) auf Basis von bestimmten Pulszeitpunkten (t L ) der ersten Lichtpulse (L1) geschätzt werden.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , dass die Probe Emitter (E), insbesondere Fluoreszenzemitter, enthält, wobei die Emitter (E) durch die Lichtpulse (L) zur Emission der Photonen (P) angeregt werden, wobei mit der Auswertevorrichtung (5) auf Basis der erfassten Photonen (P) und der Referenzzeitpunkte eine Lebensdauer der Emitter (E) bestimmt wird.
11. Vorrichtung (1) zur zeitaufgelösten Einzelphotonenmessung aufweisend - einen Detektor (4), der dazu ausgebildet ist, aufgrund von Lichtpulsen (L) von einer Probe (2) emittierte Photonen (P) zu erfassen, - eine mit dem Detektor (4) gekoppelte Auswertevorrichtung (5), die dazu ausgebildet ist, Erfassungszeitpunkte (t P ) der Photonen (P) zu bestimmen, dadurch gekennzeichnet , dass die Auswertevorrichtung (5) dazu ausgebildet ist, durch Auswertung eines Signals einer Lichtquelle (3) oder eines Sensors (11) periodisch Pulszeitpunkte (t L ) eines Teils der Lichtpulse (L) mit einer geringeren Rate als eine Repetitionsrate der Lichtpulse (L) zu bestimmen, auf Basis der bestimmten Pulszeitpunkte (t L ) Pulszeitpunkte (t L ') weiterer Lichtpulse (L) zu schätzen, und die Pulszeitpunkte (t L ) als Referenzzeitpunkte für die Erfassungszeitpunkte (t P ) der Photonen (P) zu verwenden.
12. Lichtmikroskop (10) aufweisend eine Lichtquelle (3), die dazu ausgebildet ist, Lichtpulse (L) zu erzeugen, sowie eine Vorrichtung (1) zur zeitaufgelösten Einzelphotonenmessung gemäß Anspruch 11 .
13. Computerprogramm aufweisend Programmcode, der dazu ausgebildet ist, die Vorrichtung (1) zur zeitaufgelösten Einzelphotonenmessung nach Anspruch 11 oder das Lichtmikroskop (10) nach Anspruch 12 dazu zu veranlassen, das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 durchzuführen.

Description

Technisches Gebiet der Erfindung Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur zeitaufgelösten Einzelphotonenmessung sowie eine Vorrichtung und ein Lichtmikroskop zur Durchführung des Verfahrens. Stand der Technik Die Einzelphotonenzählung ist für verschiedene Anwendungen von Vorteil, zum Beispiel in der hochauflösenden Lichtmikroskopie und der optischen Spektroskopie. Viele konfokale Fluoreszenz-Lichtmikroskope verwenden beispielsweise Detektoren mit einem Zählmodus, in dem sie das Emissionssignal durch Zählen einzelner Photonen akkumulieren. Bei der Verwendung von Detektoren, die nicht nur Photonen zählen, sondern auch die Ankunftszeiten einzelner Photonen überwachen und aufzeichnen (z. B. durch eine Methode, die als zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung (TCSPC) bezeichnet wird), können außerdem die Lebensdauern von Emittern bestimmt werden. Beispielsweise können diese zusätzlichen Informationen bei der Lebensdauer-Bildgebung verwendet werden, um ein farbkodiertes Bild der Probe zu erzeugen, wobei der Farbcode die Lebensdauerwerte widerspiegelt, die von der lokalen Umgebung der Emitter in der Probe abhängen. Darüber hinaus können mehrere Fluorophore in einem mikroskopischen Bild anhand ihrer Lebensdauern unterschieden werden, selbst wenn sich ihre Absorptions- und/oder Emissionsspektren überschneiden. Aus dem Stand der Technik sind spezialisierte Detektormodule für die zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung (TCSPC) bekannt. Diese enthalten Photonendetektoren und elektronische Schaltungen, die mit dem Photonendetektor gekoppelt sind und zum Zählen der eintreffenden Photonen und zur Bestimmung der Ankunftszeiten der einzelnen Photonen am Detektor verwendet werden können. Einen Überblick über die TCSPC- und Detektortechnologie gibt z.B. das Dokument „The bh TCSPC Handbook“, 8th Edition, September 2019, von Wolfgang Becker (https://www.beckerhickl.com/literature/documents/flim/the-bh-tcspc-handbook/). Bei Messungen der Emissionslebensdauer ist das Ergebnis der Zählelektronik in der Regel ein Histogramm der Ankunftszeiten der Photonen, dessen Form einem zeitlichen Verlauf des Emissionsabfalls mit einer entsprechenden Zeitkonstante ähnelt, die die interessierende Emissionslebensdauer ergibt. Ein Beispiel für ein Fluoreszenz-Lebensdauer-Imaging-Verfahren (FLIM), das in einem hochauflösenden Lichtmikroskop angewendet wird und auf der Einzelphotonenzählung beruht, wird in der Veröffentlichung von Marco Castello et al.: „A robust and versatile platform for image scanning microscopy enabling super-resolution FLIM“, Nature Methods, Brief Communication, https://doi.org/10.1038/s41592-018-0291-9, online veröffentlicht am 14. Januar 2019, beschrieben. Bei dem in dieser Veröffentlichung beschriebenen Verfahren wird Anregungslicht, das Fluorophore anregen kann, auf einen Bereich der Probe fokussiert, der dann auf ein Array von Einzelphotonen-Avalanche-Fotodioden (SPAD) abgebildet wird, die in einer konfokalen Ebene angeordnet sind. Anhand des Signals der Fotodioden werden die Ankunftszeiten der einzelnen Photonen am Detektor durch eine Einzelphotonenzählungselektronik bestimmt und die Fluoreszenzlebensdauer der Fluorophore aus Histogrammen der Ankunftszeiten ermittelt. In der DE 10 2024 112 112 A1 ist ein Verfahren zur Erfassung einzelner Photonen aus einer Probe (insbesondere unter Verwendung zeitkorrelierter Einzelphotonenzählung) beschrieben, bei dem eine Totzeit eines Erfassungssystems in Abhängigkeit einer Wiederholrate der Lichtpulse, einer erwarteten Emissionslebensdauer von Emittern in der Probe und insbesondere einer Anzahl von auf den Detektor einfallenden Photonen pro Lichtpuls eingestellt wird. Aus der EP 3 431 967 A1 ist ein Verfahren zur Schätzung und Korrektur von Pile-Up-Effekten in TCSPC-Anwendungen bekannt, wobei ein Zerfalls-Histogramm aus einer TCSPC-Messung erhalten wird, wobei eine Wahrscheinlichkeit geschätzt wird, dass elektrische Pulse des Detektors, die eine Photonendetektion anzeigen, einen Abstand aufweisen, der größer ist als das kleinste auflösbare Zeitintervall jedes Kanals des Zerfallshistogramms, wobei ein Funktionsfit des Zerfallshistogramms an eine auf Basis der geschätzten Wahrscheinlichkeit angepasste Modellfunktion durchgeführt wird. Beim zeitkorrelierten Einzelphotonen-Zählen werden häufig mit der Auswerteelektronik Synchronisations-Pulse und Photonen-Pulse registriert. Die Synchronisations-Pulse geben dabei den Takt der gepulsten Laserquelle an, die Photonen-Pulse stammen von einem Einzelphotonen-Detektor und zeigen die Detektion jeweiliger Einzelphotonen an. Bei vielen Systemen zur Einzelphotonen-Zählung wird für jedes gezählte Photon ein zeitlicher Abstand zu einem oder mehreren Synchronisations-Pulsen bestimmt. Dieser zeitliche Abstand wird oft gemeinsam mit dem Photonen-Puls an eine nachgelagerte Elektronik übertragen. Das Berechnen und/oder Übertragen des zeitlichen Abstands kann dabei zur Totzeit des Detektionssystems beitragen. Als Alternative zum direkten Übertragen eines Zeitabst