DE-102025105762-B3 - Lichtmikroskopisches Verfahren, lichtmikroskopische Vorrichtung und Computerprogramm

Abstract

Die Erfindung betrifft ein lichtmikroskopisches Verfahren, wobei eine Probe (2) mit fokussiertem gepulstem Anregungslicht (A) beleuchtet wird, um mindestens zwei Arten von Emittern (E) mit unterschiedlichen Emissionslebensdauern zur Lichtemission anzuregen, wobei die Probe (2) zusätzlich mit einer Intensitätsverteilung von Verhinderungslicht (V) mit einem lokalen Minimum beleuchtet wird, um Emitter (E) außerhalb des lokalen Minimums abzuregen, wobei von der Probe (2) ausgehende Photonen von einem Detektor (4) erfasst werden, wobei auf Basis der erfassten Photonen (P) eine Phasoranalyse durchgeführt wird, um Photonen der verschiedenen Arten von Emittern (E) auf Basis ihrer Emissionslebensdauer zu trennen, wobei ein Gating der Photonen durchgeführt wird, wobei für Anregungspulse (p A ) des Anregungslichts (A) jeweilige Gating-Zeitintervalle (10) vorgesehen sind, und wobei bei der Phasoranalyse nur diejenigen Photonen (P) berücksichtigt werden, in dem jeweiligen Gating-Zeitintervall (10) erfasst werden, sowie eine lichtmikroskopische Vorrichtung (1) und ein Computerprogramm zur Durchführung des Verfahrens.

Inventors

• Andreas SCHÖNLE
• Joachim Fischer

Assignees

• ABBERIOR INSTRUMENTS GMBH

Dates

Publication Date

20260507

Application Date

20250217

Claims (13)

1. Lichtmikroskopisches Verfahren, wobei eine Probe (2) mit fokussiertem gepulstem Anregungslicht (A) beleuchtet wird, um mindestens zwei Arten von Emittern (E) mit unterschiedlichen Emissionslebensdauern zur Lichtemission anzuregen, wobei die Probe (2) zusätzlich mit einer Intensitätsverteilung von Verhinderungslicht (V) mit einem lokalen Minimum beleuchtet wird, um Emitter (E) außerhalb des lokalen Minimums abzuregen, wobei von der Probe (2) ausgehende Photonen (P) von einem Detektor (4) erfasst werden, wobei auf Basis der erfassten Photonen (P) eine Phasoranalyse durchgeführt wird, um Photonen (P) der verschiedenen Arten von Emittern (E) auf Basis ihrer Emissionslebensdauer zu trennen, dadurch gekennzeichnet , dass ein Gating der Photonen (P) durchgeführt wird, wobei für Anregungspulse (p A ) des Anregungslichts (A) jeweilige Gating-Zeitintervalle (10) vorgesehen sind, und wobei bei der Phasoranalyse nur diejenigen Photonen (P) berücksichtigt werden, die in dem jeweiligen Gating-Zeitintervall (10) erfasst werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet , dass ein Nullpunkt einer der Phasoranalyse zugrundeliegenden Zeitskala auf einen Anfangszeitpunkt (t 0 ') des Gating-Zeitintervalls (10) gesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet , dass das Verhinderungslicht (V) in Verhinderungspulsen (p V ) auf die Probe (2) eingestrahlt wird, wobei ein Zeitintervall zwischen einem Anregungspuls (p A ) und einem Anfangszeitpunkt (t 0 ') des jeweiligen Gating-Zeitintervalls (10) mit einem jeweiligen Verhinderungspuls (p V ) zeitlich überlappt.
4. Verfahren nach Anspruch 3 , dadurch gekennzeichnet , dass der zeitliche Abstand zwischen einem Anregungspuls (p A ) und dem Anfangszeitpunkt (t 0 ') des jeweiligen Gating-Zeitintervalls (10) mindestens einer Pulslänge des jeweiligen Verhinderungspulses (p V ) entspricht.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4 , dadurch gekennzeichnet , dass die Verhinderungspulse (p V ) mit einer Pulsverzögerung relativ zu einem jeweils vorhergehenden Anregungspuls (p A ) auf die Probe (2) eingestrahlt werden, wobei der zeitliche Abstand zwischen einem Anregungspuls (p A ) und dem Anfangszeitpunkt (t 0 ') des jeweiligen Gating-Zeitintervalls (10) mindestens der Summe der Pulslänge des Verhinderungspulses (p V ) und der Pulsverzögerung entspricht.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 , dadurch gekennzeichnet , dass die von der Probe (2) ausgehenden Photonen (P) nur während des Gating-Zeitintervalls (10) von dem Detektor (4) erfasst oder nur während des Gating-Zeitintervalls (10) von einer mit dem Detektor (4) gekoppelten Auswertevorrichtung (41) registriert werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 , dadurch gekennzeichnet , dass die von der Probe (2) ausgehenden Photonen (P) zwischen einem Anregungspuls (p A ) und dem Anfangszeitpunkt (t 0 ') des jeweiligen Gating-Zeitintervalls (10) zwar erfasst und registriert werden, jedoch aus einem bei der Phasoranalyse verwendeten Datensatz ausgeschlossen werden.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , dass die Probe (2) mit einem Fokus des Anregungslichts (A), mit dem die Intensitätsverteilung des Verhinderungslichts (V) überlagert ist, gescannt wird, wobei für jeweilige Positionen des Fokus in der Probe (2) erfasste Photonen (P) jeweiligen Bildpixeln zugeordnet werden.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , dass der Detektor (4) mit einer oder der Auswertevorrichtung (41) gekoppelt ist, wobei von der Auswertevorrichtung (41) auf Basis einer von dem Detektor (4) an die Auswertevorrichtung (41) übertragenen Signalpulsfolge von Photonensignalen ohne Speicherung einzelner Photonensignale Realteile (G) und Imaginärteile (S) jeweiliger Phasoren (P1,P2,P3) berechnet werden, auf deren Basis die Phasoranalyse durchgeführt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9 , soweit rückbezogen auf Anspruch 8 , dadurch gekennzeichnet , dass von der Auswertevorrichtung (41) für jedes Bildpixel jeweils ein Realteil (G) und ein Imaginärteil (S) eines Phasors (P1,P2,P3) berechnet wird.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , dass das Verhinderungslicht (V) zumindest auf erste Emitter (E) in der Probe (2) wirkt, indem die ersten Emitter (E) außerhalb des lokalen Minimums des Verhinderungslichts (V) abgeregt werden, wobei die ersten Emitter (E) eine längere Emissionslebensdauer aufweisen als zweite Emitter (E) in der Probe (2).
12. Lichtmikroskopische Vorrichtung (1), insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , wobei die Vorrichtung (1) zumindest die folgenden Komponenten aufweist: - eine Beleuchtungsvorrichtung (3), die dazu ausgebildet ist, eine Probe (2) mit fokussiertem gepulstem Anregungslicht (A) zu beleuchten, um mindestens zwei Arten von Emittern (E) mit unterschiedlichen Emissionslebensdauern zur Lichtemission anzuregen, und die Probe (2) zusätzlich mit einer Intensitätsverteilung von Verhinderungslicht (V) mit einem lokalen Minimum zu beleuchten, um Emitter (E) außerhalb des lokalen Minimums abzuregen, - einen Detektor (4), der dazu ausgebildet ist, von der Probe (2) ausgehende Photonen (P) zu erfassen, und - eine Recheneinheit (5), die dazu ausgebildet ist, auf Basis der erfassten Photonen (P) eine Phasoranalyse durchzuführen, um Photonen (P) der verschiedenen Arten von Emittern (E) auf Basis ihrer Emissionslebensdauern zu trennen, dadurch gekennzeichnet , dass die lichtmikroskopische Vorrichtung (1), insbesondere eine Auswertevorrichtung (41) oder die Recheneinheit (5) der lichtmikroskopischen Vorrichtung (1), dazu ausgebildet ist, ein Gating der Photonen (P) durchzuführen, indem für Anregungspulse (p A ) des Anregungslichts (A) jeweilige Gating-Zeitintervalle (10) vorgesehen sind, wobei die Recheneinheit (5) dazu ausgebildet ist, bei der Phasoranalyse nur diejenigen Photonen (P) zu berücksichtigen, die jeweils in dem jeweiligen Gating-Zeitintervall (10) erfasst werden.
13. Computerprogramm aufweisend Befehle, die bewirken, dass die lichtmikroskopische Vorrichtung (1) nach Anspruch 12 das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 durchführt.

Description

Technisches Gebiet der Erfindung Die Erfindung betrifft ein lichtmikroskopisches Verfahren, insbesondere unter Verwendung von Verhinderungslicht zur Erhöhung der Auflösung sowie einer Lebensdaueranalyse zur Trennung der Signale verschiedener Emitter. Weitere Aspekte der Erfindung sind eine Vorrichtung und ein Computerprogramm zur Durchführung des Verfahrens. Stand der Technik In der Lichtmikroskopie kann eine Lebensdaueranalyse, insbesondere Fluoreszenzlebensdaueranalyse, z.B. eingesetzt werden, um die Signale unterschiedlicher Arten von Emittern, insbesondere Fluorophoren oder mit Fluorophoren markierten Probenstrukturen, zu trennen. Auf diese Weise lassen sich auch Signale von Emittern trennen, welche ein stark überlappendes oder sogar identisches Emissionsspektrum haben, deren emittiertes Licht also nicht z.B. über wellenlängenabhängige optische Filter getrennt werden kann, solange die Emitter unterschiedliche Lebensdauern aufweisen. Als Lebensdauer wird hier insbesondere eine mittlere Zeit nach einer Anregung durch Anregungslicht verstanden, nach der ein Photon emittiert wird. Bei in der Fluoreszenzmikroskopie üblichen Fluoreszenzfarbstoffen liegen die Lebensdauern in der Regel im Bereich zwischen Bruchteilen von Nanosekunden bis zu mehreren Nanosekunden. Lebensdauern können experimentell z.B. durch zeitkorreliertes Einzelphotonenzählen (TCSPC) bestimmt werden. Dabei wird die Probe periodisch mit Anregungs-Laserpulsen beleuchtet und das Detektionslicht aus der Probe (insbesondere Fluoreszenzlicht) wird mit einem Detektor erfasst, der in der Lage ist, einzelne Photonen zu detektieren und deren Ankunftszeit am Detektor mit einer Genauigkeit im Pikosekundenbereich zu bestimmen, z.B. einer Avalanche-Fotodiode, die mit einer entsprechenden Auswerteelektronik gekoppelt ist. Aus der Zeitdifferenz einer Vielzahl von Photonensignalen zum jeweiligen vorhergehenden Laserpuls kann eine zeitliche Verteilung der Ankunftszeiten bestimmt werden, die z.B. als Histogramm dargestellt werden kann. Aus diesem Histogramm kann, z.B. durch Funktionsfit oder durch Phasorplotanalyse (s.u.) die Lebenszeit bestimmt werden. Alternativ zum zeitkorrelierten Einzelphotonenzählen kann eine Lebenszeitanalyse auch auf Basis von Frequenzdaten durchgeführt werden, indem eine Probe zeitlich moduliert im Weitfeld beleuchtet wird und die Emissionssignale mit einer Gating-fähigen Kamera aufgezeichnet werden. In diesem Fall lässt sich aus der Phasenverschiebung zwischen der periodischen Anregung und dem modulierten Emissionssignal sowie aus der Modulationstiefe die Lebenszeit von Emittern bestimmen. Eine Lebenszeitanalyse auf Basis von Zeitdaten, also mittels des zeitkorrelierten Einzelphotonenzählens, kann z.B. mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop durchgeführt werden, wobei die Laserpulse in die Probe fokussiert werden und der Laserfokus, z.B. mit einer Galvoscanvorrichtung, durch die Probe gescannt wird und aus den Intensitäten bzw. Photonenzahlen des an den verschiedenen Probenpositionen erfassten Detektionslichts Pixelintensitäten eines Rasterbildes berechnet werden. Zusätzlich zu der Gesamtintensität kann für jedes Pixel eine Lebenszeitanalyse durchgeführt werden. Dabei werden in der Regel für jede Probenposition die Ankunftszeiten einer Vielzahl von Photonen analysiert. Lebensdauern können dabei z.B. durch einen Funktionsfit der Ankunftszeitverteilung an eine monoexponentielle oder multiexponentielle Funktion bestimmt werden. Wenn das Signal von einer einzigen Emitterspezies stammt, deren Ankunftszeiten monoexponentiell verteilt sind (dies ist für viele Fluoreszenzfarbstoffe der Fall), lässt sich auf diese Weise das entsprechende Signal einer Emitterspezies zuordnen. Im Fall eines Mischsignals, das von mehreren Emitterarten unterschiedlicher Lebensdauern stammt, lässt sich prinzipiell durch einen Funktionsfit der Ankunftszeitdaten an eine multiexponentielle Funktion der Anteil der unterschiedlichen Emitterarten an dem Signal bestimmen. Auf diese Weise können die Signale getrennt werden und es können z.B. zwei Rasterbilder unterschiedlicher Lebensdauerkanäle berechnet und dargestellt werden. Die Trennung von Emissionssignalen mittels Funktionsfit ist jedoch insbesondere bei schwachen Signalen, also relativ wenigen erfassten Photonen, anspruchsvoll und fehleranfällig, insbesondere da das zugrundeliegende Modell des Funktionsfits vorab nicht bekannt ist, und keine klar definierten Kriterien vorliegen, wann eine Übereinstimmung mit dem Modell vorliegt. Als Alternative zum Funktionsfit erlaubt die Phasorplotanalyse eine grafische Auswertung von Lebenszeitdaten und ist grundsätzlich in der Lage, die Signale von Emittern unterschiedlicher charakteristischer Lebensdauern voneinander zu trennen. Bei der Phasorplotanalyse auf Basis von Ankunftszeitdaten (d.h. insbesondere TCSPC-basiert) werden für jedes Scanpixel Koordinaten eines Phasors, nämlich ein Realteilg(ω)=∫t0∞I(t)cos(ωt)∫t0∞I(t)und ein Imaginärteils(ω)=∫t0∞I(t)sin(ωt)∫t0∞I(t)bestim