JP-2025514271-A5 -

Dates

Publication Date

20260513

Application Date

20230428

Description

装置がプログラムを完了した後、シリンジ番号1、3、及び5を収集し、標的及び非標的の画分中の純度及び生存率を測定する。結果を、分離の前後の試料中の標的細胞の純度及び生存率として表す図16a及び図16bに示す。細胞の純度は、Miltenyi MACSQuant(登録商標)VYB Flow Cytometerを用いて決定した。細胞は、1:400の濃度のMiltenyi抗ヒトCD90 PE-Vio(登録商標)770抗体(カタログ番号130-114-904)を用いて染色した。これらは、室温、暗所で10分、インキュベートし、1×PBS、0.5%のBSA、及び2mMのEDTAを含む緩衝液で、メーカーのプロトコルに従って洗浄した。それぞれの試料を、450μL中、ゲートP4(生存している単一細胞)で、20'000事象について読み取った。細胞の生存率は、Miltenyi MACSQuant(登録商標)VYB Flow Cytometerを用いて決定した。細胞は、Propidium Iodide Solution(Miltenyi、カタログ番号130-093-233)を用い、濃度1:1000で、メーカーのプロトコルに従って染色した。細胞は室温、暗所で5分、インキュベートし、MACS緩衝液で洗浄した。それぞれの試料を、400μL中、20'000事象について読み取った。データ解析はMACSQuantify(商標)Softwareを用いて実施した。 本出願は、以下を提供する。 １． 試料から生存可能な標的細胞を分離する方法であって、 a.細胞表面上に分子を呈示する生存可能な標的細胞の懸濁液を含む試料を、約1.45g/cm3以上の密度、約10μm～200μmの直径を有する非多孔性微粒子であって、前記分子に特異的に結合することができる捕捉リガンドが前記微粒子の表面に共有結合で固定化されている非多孔性微粒子と接触させるステップ、 b.前記試料を実質的に掻き混ぜることなくインキュベートして、標的細胞/微粒子複合体を形成させるステップ、 c.前記標的細胞/微粒子複合体を保持しつつ、フィルターを通して未結合物質を洗浄することによって前記標的細胞/微粒子複合体から前記試料中の前記未結合物質を分離するステップ、 d.前記標的細胞/微粒子複合体を機械的に解離し、前記捕捉リガンドが前記微粒子の表面に共有結合で固定化されている前記微粒子を保持しつつ、前記フィルターを通して前記生存可能な標的細胞を溶出させるステップ を含む方法。 ２． 標的細胞が細胞療法に適する、上記1に記載の方法。 ３． 捕捉リガンドが、10-5～10-12、より好ましくは10-9～10-11、又はより好ましくは10-7～10-10、より好ましくは約10-9のオーダーの解離定数で前記標的細胞の表面における前記分子に特異的に結合する、上記1又は上記2に記載の方法。 ４． 捕捉リガンドが、抗体、FabFc2、Fab、Fv、Fd、F(ab')2、軽鎖及び重鎖の可変領域のみを含むFv断片、可変領域及び定常領域の一部を含むFab若しくはF(ab')2断片、一本鎖抗体、scFv、CDRグラフト化抗体、dAb、及び／又はナノボディの群から選択される、上記1から3のいずれか一項に記載の方法。 ５． 前記細胞表面分子が、ヒトCD2、CD3、CD4、CD8、CD11a、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD30、CD31、CD34、CD38、CD43、CD45、CD48、CD56、CD61、CD73、CD90、CD91、CD105、CD114、CD117、CD140b、CD150、CD182、CD184、CD271、CDCP1、GD2、GPR4、Sca-1、及びSTRO-1の群から選択される、上記1から4のいずれか一項に記載の方法。 ６． 溶出した生存可能な標的細胞の生存可能な標的細胞懸濁液を含む医薬を取得するステップをさらに含み、溶出した生存可能な標的細胞懸濁液が捕捉リガンドを本質的に含まない、上記1から5のいずれか一項に記載の方法。 ７． 標的細胞が、ヒト顆粒球、Tリンパ球、単球、T制御細胞、Tヘルパー細胞、細胞傷害性T細胞、Bリンパ球、腫瘍浸潤性リンパ球、血小板、ナチュラルキラー細胞、造血幹細胞及び前駆細胞、間葉系/間質幹細胞、毛嚢幹細胞、心幹細胞、多能性筋細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、歯髄細胞、歯周靭帯細胞、網膜色素上皮細胞、脂肪組織由来幹細胞及び前駆細胞、胚幹細胞及び人工多能性幹細胞を含む多能性幹細胞、Car-T細胞、微小血管内皮細胞(MVEC)、初代上皮細胞、例えば角化細胞、頸管上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎上皮細胞及び網膜上皮細胞、心、肝、腎、結腸、腸、食道、胃、脳及び脊髄由来の神経組織、肺、動脈、静脈及び毛細血管由来の血管組織、リンパ腺、アデノイド、扁桃腺、骨髄、及び血液由来のリンパ様組織を含む任意の組織又は器官由来の線維芽細胞、脾、筋肉細胞、膵細胞、心細胞、及びこれらの初代細胞から確立された細胞の群から選択される、上記1から6のいずれか一項に記載の方法。 ８． 標的細胞が、単球、Tリンパ球、Bリンパ球、CAR-T細胞、及び幹細胞の群から選択される、上記1から7のいずれか一項に記載の方法。 ９． 前記試料が、ヒト全血、アフェレーシス、骨髄吸引物、生検、液化組織、例えば酵素分解された脂肪吸引物、細胞培養物、バイオリアクター培養物、腫瘍細胞、単一細胞懸濁液の群から選択される、上記1から8のいずれか一項に記載の方法。 １０． 上記1から9のいずれか一項に記載の方法に従って試料から生存可能な標的細胞を分離するのに使用されるように構成された、閉鎖されたハウジングカートリッジ。 １１． - 入口ポート及び出口ポートを有するユニットの中に封入されたフィルター、 - フィルターの入口に接続された流体導管であって、標的細胞を含む試料の供給源、非多孔性微粒子の懸濁液の供給源、洗浄溶液の供給源、及び溶出溶液の供給源の流れを制御することができる1つ以上のバルブを有する流体導管、並びに - 1つ以上のバルブを含む、フィルターの出口に接続された流体導管であって、1つのバルブが、流体導管を介して標的細胞溶液を標的細胞収集容器へ、又は洗浄溶液及び未結合物質のための異なる容器へ、方向転換させることができる、流体導管 を含む、上記10に記載の閉鎖されたハウジングカートリッジ。 １２． 上記10又は11に記載の閉鎖されたハウジングカートリッジと、約1.45g/cm3以上の密度、約10μm～200μmの直径を有する非多孔性微粒子であって、細胞表面上の分子に特異的に結合することができる捕捉リガンドが前記微粒子の表面に共有結合で固定化されている非多孔性微粒子の懸濁液を含む容器とを含む部品のキット。 １３． 閉鎖されたハウジングカートリッジ又は部品のキットの構成要素が、シールされた無菌包装の中に含まれている、上記10若しくは11に記載の閉鎖されたハウジングカートリッジ又は上記12に記載の部品のキット。 １４． 前記非多孔性微粒子が約1.95g/cm3以上の密度を有する、上記1から9のいずれか一項に記載の方法又は上記12若しくは13に記載の部品のキット。 １５． 前記非多孔性微粒子が約35μm～50μmの直径を有する、上記1から9及び14のいずれか一項に記載の方法又は上記12から14のいずれか一項に記載の部品のキット。 １６．前記非多孔性微粒子が二酸化ケイ素(SiO2)から作製されている、上記1から9、14、及び15のいずれか一項に記載の方法又は上記12から15のいずれか一項に記載の部品のキット。 １７． 溶出した生存可能な標的細胞懸濁液が、標的細胞表面上に呈示される分子に特異的に結合する捕捉リガンド抗体を本質的に含まない、上記1から9のいずれか一項に記載の方法。 １８． 上記1から9のいずれか一項に記載の方法に従って試料から生存可能な標的細胞を分離するように構成された装置であって、 - 上記10又は11に記載の閉鎖されたハウジングカートリッジのバルブが電子的制御システムによって機械的に操作されるように、前記カートリッジを安全に（securely）取り付ける手段、 - 前記カートリッジを1つ以上の溶液及び/又は懸濁液を含む1つ以上の容器に接続する手段、 - 溶液及び/又は懸濁液を移動させる手段、並びに - 上記1から9のいずれか一項に記載の方法を実施している間、前記カートリッジのバルブを介して溶液及び/又は懸濁液の流れを設定し、測定し、及び/又は調節するように構成された制御システム を含む装置。 １９． 1つ以上の前処理フィルター、キーボード、タッチスクリーン、バーコード読み取りデバイス、WIFI、近距離通信(NFC)若しくはブルートゥース(登録商標)のための通信エレメント、モーター、いずれか若しくは全てのポンプ又はモーターのための振動絶縁ユニット、圧力、流量、インピーダンス、電導度、抵抗、電流、pH、温度、湿度、ガスパーセンテージ、放射線、運動、体積、重量、磁束、時間、濁度、光学密度を測定するセンサー又は電極、アラーム、細胞計数デバイス、加熱ユニット、冷却ユニット、グラフィック表示ユニット、データ保存デバイス、例えばCD、USBフラッシュ駆動スティック、又はNFCのためのポートを含む、上記18に記載の装置。 ２０． 上記6から9のいずれか一項に記載の方法に従って得られる生存可能な標的細胞懸濁液を含む医薬であって、溶出した生存可能な標的細胞懸濁液が捕捉リガンドを本質的に含まない、医薬。 ２１． 医薬としての使用のための上記6から9のいずれか一項に記載の方法に従って得られる生存可能な標的細胞懸濁液であって、溶出した生存可能な標的細胞懸濁液が捕捉リガンドを本質的に含まない、生存可能な標的細胞懸濁液。 ２２． 上記6から9のいずれか一項に記載の方法によって得られる生存可能な標的細胞懸濁液を必要とする対象を処置する方法であって、疾患の防止及び/又は処置のために、捕捉リガンドを本質的に含まない前記生存可能な標的細胞懸濁液を前記対象に投与するステップを含む方法。