JP-2025514304-A5 -

Dates

Publication Date

20260512

Application Date

20230428

Description

別の態様では、目的の組織又は細胞型において１つ以上のゲノムセーフハーバー遺伝子座を同定する方法が提供される。いくつかのそのような方法は、（ａ）目的の組織又は細胞型においてアクセス可能なゲノム遺伝子座を同定することと、（ｂ）安全基準、機能的サイレンシング基準、及び／又は構造的アクセス可能性基準に基づいて、工程（ａ）で同定したゲノム遺伝子座を選択することと、（ｃ）ガイドＲＮＡの利用可能性、有効性、及び特異性に基づいて、工程（ｂ）で同定したゲノム遺伝子座を選択することと、を含む。いくつかのそのような方法では、工程（ａ）は、ハイスループット配列決定によるトランスポザーゼアクセス可能クロマチンについてのアッセイを使用して、アクセス可能なゲノム遺伝子座を同定することを含む。いくつかのそのような方法では、工程（ａ）は、ＤＮａｓｅ Ｉ高感受性部位配列決定を使用して、アクセス可能なゲノム遺伝子座を同定することを含む。いくつかのそのような方法では、工程（ａ）は、ハイスループット配列決定及びＤＮａｓｅ Ｉ高感受性部位配列決定によるトランスポザーゼアクセス可能クロマチンについてのアッセイを使用して、アクセス可能なゲノム遺伝子座を同定することを含む。いくつかのそのような方法では、工程（ｂ）は、安全基準、機能的サイレンシング基準、及び構造的アクセス可能性基準に基づいて、工程（ａ）で同定したゲノム遺伝子座を選択することを含む。いくつかのそのような方法では、工程（ｂ）の安全基準は、ゲノム遺伝子座が任意のがん関連遺伝子から３００ｋｂ超、任意のｍｉＲＮＡ又は低分子ＲＮＡから３００ｋｂ超、かつ任意の遺伝子の５’末端から５０ｋｂ超である場合にのみ、ゲノム遺伝子座を選択することを含む。いくつかのそのような方法では、工程（ｂ）の機能的サイレンシング基準は、ゲノム遺伝子座が任意の複製起点から５０ｋｂ超、かつ任意の超保存エレメントから５０ｋｂ超である場合にのみ、ゲノム遺伝子座を選択することを含む。いくつかのそのような方法では、工程（ｂ）の構造的アクセス可能性基準は、ゲノム遺伝子座がコピー数可変領域にない場合にのみゲノム遺伝子座を選択することを含む。いくつかのそのような方法では、工程（ｃ）の有効性は、目的の組織又は細胞型における有効性を編集することを含む。いくつかのそのような方法では、方法は、工程（ｃ）で選択したゲノム遺伝子座のクロマチン環境をマーカーについて分析して、調節領域、ヘテロクロマチン領域、クロマチン三次元構成に関与する領域、又は転写活性領域であると予測される領域内にある任意のゲノム遺伝子座を不適格とすることを更に含む。いくつかのそのような方法では、調節領域のマーカーは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、及びＨ３Ｋ４ｍｅ３を含む。いくつかのそのような方法では、ヘテロクロマチン領域のマーカーは、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３を含む。いくつかのそのような方法では、クロマチン三次元構成に関与する領域のマーカーは、ＣＴＣＦを含む。いくつかのそのような方法では、転写活性領域のマーカーは、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３、ＰｏｌＲ２Ａ、ＲＮＡＳｅｑ－、及びＲＮＡＳｅｑ＋を含む。いくつかのそのような方法では、工程（ａ）は、ハイスループット配列決定及びＤＮａｓｅ Ｉ高感受性部位配列決定によるトランスポザーゼアクセス可能クロマチンについてのアッセイを使用してアクセス可能なゲノム遺伝子座を同定することを含み、工程（ｂ）は、安全基準、機能的サイレンシング基準、及び構造的アクセス可能性基準に基づいて、工程（ａ）で同定したゲノム遺伝子座を選択することを含み、工程（ｂ）の安全基準は、ゲノム遺伝子座が任意のがん関連遺伝子から３００ｋｂ超、任意のｍｉＲＮＡ又は低分子ＲＮＡから３００ｋｂ超、かつ任意の遺伝子の５’末端から５０ｋｂ超である場合にのみ、ゲノム遺伝子座を選択することを含み、工程（ｂ）の機能的サイレンシング基準は、ゲ ノム遺伝子座が任意の複製起点から５０ｋｂ超、かつ任意の超保存エレメントから５０ｋｂ超である場合にのみ、ゲノム遺伝子座を選択することを含み、工程（ｂ）の構造的アクセス可能性基準は、ゲノム遺伝子座がコピー数可変領域にない場合にのみゲノム遺伝子座を選択することを含み、方法は、工程（ｃ）で選択したゲノム遺伝子座のクロマチン環境をマーカーについて分析して、調節領域、ヘテロクロマチン領域、クロマチン三次元構成に関与する領域、又は転写活性領域であると予測される領域内にある任意のゲノム遺伝子座を不適格とすることを更に含み、調節領域のマーカーは、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、及びＨ３Ｋ４ｍｅ３を含み、ヘテロクロマチン領域のマーカーは、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３を含み、クロマチン三次元構成に関与する領域のマーカーは、ＣＴＣＦを含み、転写活性領域のマーカーは、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３、ＰｏｌＲ２Ａ、ＲＮＡＳｅｑ－、及びＲＮＡＳｅｑ＋を含む。いくつかのそのような方法では、方法は、目的のヒト組織又は細胞型において１つ以上のゲノムセーフハーバー遺伝子座を同定するためのものである。いくつかのそのような方法では、目的の組織又は細胞型は肝臓である。いくつかのそのような方法では、目的の組織又は細胞型は造血細胞である。 本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。 （項目１） 核酸構築物をヒト細胞内のゲノムセーフハーバー遺伝子座に組み込む方法であって、前記ヒト細胞に、 （ａ）ヌクレアーゼ剤又は前記ヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸であって、前記ヌクレアーゼ剤は、前記ゲノムセーフハーバー遺伝子座におけるヌクレアーゼ標的部位を標的とし、前記ゲノムセーフハーバー遺伝子座は、次のゲノム位置、すなわち、 （ｉ）ヒト１３番染色体上の約７７４６０２４２～約７７４６０５３７のゲノム座標、 （ｉｉ）ヒト６番染色体上の約１７００３１０８４～約１７００３１３８２のゲノム座標、及び （ｉｉｉ）ヒト９番染色体上の約２５２０７４１２～約２５２０７７０３のゲノム座標から選択される、ヌクレアーゼ剤又は前記ヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸、並びに （ｂ）前記核酸構築物であって、前記核酸構築物は、プロモーターに作動可能に連結された核酸を含み、前記核酸は、目的の産物をコードする、前記核酸構築物を投与することを含み、 前記ヌクレアーゼ剤は、前記ヌクレアーゼ標的部位を切断し、前記核酸構築物は、前記ゲノムセーフハーバー遺伝子座に挿入される、方法。 （項目２） ヒト細胞内のゲノムセーフハーバー遺伝子座から目的の産物を発現させる方法であって、前記ヒト細胞に、 （ａ）ヌクレアーゼ剤又は前記ヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸であって、前記ヌクレアーゼ剤は、前記ゲノムセーフハーバー遺伝子座におけるヌクレアーゼ標的部位を標的とし、前記ゲノムセーフハーバー遺伝子座は、次のゲノム位置、すなわち、 （ｉ）ヒト１３番染色体上の約７７４６０２４２～約７７４６０５３７のゲノム座標、 （ｉｉ）ヒト６番染色体上の約１７００３１０８４～約１７００３１３８２のゲノム座標、及び （ｉｉｉ）ヒト９番染色体上の約２５２０７４１２～約２５２０７７０３のゲノム座標から選択される、ヌクレアーゼ剤又は前記ヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸、並びに （ｂ）核酸構築物であって、前記核酸構築物は、プロモーターに作動可能に連結された核酸を含み、前記核酸は、前記目的の産物をコードする、核酸構築物を投与することを含み、 前記ヌクレアーゼ剤は前記ヌクレアーゼ標的部位を切断し、前記核酸構築物は前記ゲノムセーフハーバー遺伝子座に挿入されて、修飾ゲノムセーフハーバー遺伝子座を作製し、前記目的の産物は、前記修飾ゲノムセーフハーバー遺伝子座から発現する、方法。 （項目３） 前記ヒト細胞は肝臓細胞である、項目１又は２に記載の方法。 （項目４） 前記ヒト細胞は肝細胞である、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。 （項目５） 前記ヒト細胞はインビトロ又はエクスビボである、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。 （項目６） 前記ヒト細胞は、インビボで対象に存在する、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。 （項目７） 核酸構築物を、ヒト対象のヒト細胞内のゲノムセーフハーバー遺伝子座に組み込む方法 であって、前記ヒト対象に、 （ａ）ヌクレアーゼ剤又は前記ヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の核酸であって、前記ヌクレアーゼ剤は、前記ゲノムセーフハーバー遺伝子座におけるヌクレアーゼ標的部位を標的とし、前記ゲノムセーフハーバー遺伝子座は、次のゲノム位置、すなわち、 （ｉ）ヒト１３番染色体上の約７７４６０２４２～約７７４６０５３７のゲノム座標、 （ｉｉ）ヒト６番染色体上の約１７００３１０