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JP-2026077356-A - ヌクレオチド濃度測定方法及びヌクレオチド濃度測定システム

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Abstract

【課題】ＲＮＡを構成する各ヌクレオチドの濃度を簡易的に測定することが可能な、測定方法及び測定システムを提供する。 【解決手段】ＲＮＡを構成する各ヌクレオチドの濃度を測定する方法であって、ＲＮＡを含むサンプル又はＲＮＡに由来する各ヌクレオチドを含むサンプルに対して光を照射し、出射光に関する実測スペクトルデータを得る、光照射工程と、前記実測スペクトルデータについて、あらかじめ取得しておいた各ヌクレオチドの濃度ごとの出射光に関する参照スペクトルデータを用いた演算を行うことにより、各ヌクレオチドの濃度を導出する、演算工程と、を含む、ことを特徴とする、ヌクレオチド濃度測定方法。 【選択図】図１

Inventors

  • 小鑓 卓朗
  • 小田桐 広和
  • 齋藤 広介
  • 嶋田 和人

Assignees

  • デクセリアルズ株式会社

Dates

Publication Date
20260513
Application Date
20241025

Claims (7)

  1. ＲＮＡを構成する各ヌクレオチドの濃度を測定する方法であって、 ＲＮＡを含むサンプル又はＲＮＡに由来する各ヌクレオチドを含むサンプルに対して光を照射し、出射光に関する実測スペクトルデータを得る、光照射工程と、 前記実測スペクトルデータについて、あらかじめ取得しておいた各ヌクレオチドの濃度ごとの出射光に関する参照スペクトルデータを用いた演算を行うことにより、各ヌクレオチドの濃度を導出する、演算工程と、 を含む、ことを特徴とする、ヌクレオチド濃度測定方法。
  2. 前記実測スペクトルデータ及び前記参照スペクトルデータが、透過光に関するスペクトルデータ、反射光に関するスペクトルデータ、又はその両方である、請求項１に記載のヌクレオチド濃度測定方法。
  3. 前記実測スペクトルデータ及び前記参照スペクトルデータが、２００ｎｍ以上３００ｎｍ以下の波長範囲のデータである、請求項１に記載のヌクレオチド濃度測定方法。
  4. ＲＮＡを構成する各ヌクレオチドの濃度を測定するためのシステムであって、 ＲＮＡを含むサンプル又はＲＮＡに由来する各ヌクレオチドを含むサンプルを保持可能な、サンプル保持部と、 前記サンプル保持部に保持されたサンプルに対して光を照射可能な、光照射部と、 前記サンプルに対して光を照射した際の出射光を受信可能な、受光素子と、 前記受光素子が受信した出射光に関する実測スペクトルデータを作成する、データ作成部と、 各ヌクレオチドの濃度ごとの出射光に関する参照スペクトルデータをあらかじめ搭載可能であり、前記データ作成部で作成された実測スペクトルデータについて、前記参照スペクトルデータを用いた演算を行うことにより、各ヌクレオチドの濃度を導出する、演算モジュールと、 を備える、ことを特徴とする、ヌクレオチド濃度測定システム。
  5. 前記光照射部が、サンプルに照射される光の波長を限定するためのバンドパスフィルタを有する、請求項４に記載のヌクレオチド濃度測定システム。
  6. 前記実測スペクトルデータ及び前記参照スペクトルデータが、透過光に関するスペクトルデータ、反射光に関するスペクトルデータ、又はその両方である、請求項４に記載のヌクレオチド濃度測定システム。
  7. 前記実測スペクトルデータ及び前記参照スペクトルデータが、２００ｎｍ以上３００ｎｍ以下の波長範囲のデータである、請求項４に記載のヌクレオチド濃度測定システム。

Description

本発明は、ヌクレオチド濃度測定方法及びヌクレオチド濃度測定システムに関する。 ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸は、生体における遺伝子情報の蓄積又は処理などを担う物質である。このような核酸を確認する方法として、いくつかの手段が存在する。 例えば、核酸の配列又は構造を決定する手段としては、次世代シーケンシング、ＮＭＲ（核磁気共鳴）などが挙げられる。また、核酸の濃度を測定する手段として、波長２６０ｎｍにおける吸光度の検量線を作成することによる定量化が挙げられる。かかる定量化は、核酸全体として波長２６０ｎｍに吸収極大を持つことに着目した技術である。そして、上述したいずれの手段も、それぞれ既に製品化に至っている。 上述したもののほか、特許文献１は、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）によって検出可能な改変分子ビーコンを用い、サンプル中の特定の核酸配列を検出又は同定する技術を開示している。かかる特許文献１では、具体的には、サンプル核酸における標的ヌクレオチド配列の存在又は不存在を決定する方法が開示されている。 また、特許文献２は、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖のＤＮＡ鎖にニック形成し、その生成物を増幅するプロセスに基づいて、サンプル中の標的ＲＮＡ配列を検出する技術を開示している。 また、特許文献３は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含むサンプルの分光光度計データを分析するための、コンピュータ実行方法を開示している。この方法では、具体的には、アデニン－チミン（ＡＴ）、グアニン－シトシン（ＧＣ）、アデニン－ウラシル（ＡＵ）から選択される塩基対の含有量が測定される。 特表２００７－５０３５８１号公報特表２０２３－５５３８６０号公報特表２０１４－５１２５１７号公報 各ヌクレオチドについての、波長と透過率の関係を表すスペクトルデータである。ＡＭＰ濃度と透過率の関係を表すデータである。各ヌクレオチドの濃度についての、理論値と演算値との関係を表すデータである。 以下、本発明の概要を説明した上で、本発明のヌクレオチド濃度測定方法及びヌクレオチド濃度測定システムを、実施形態に基づき詳細に説明する。 ＜発明の概要＞ ＲＮＡは、４種の塩基（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））のヌクレオチドが連結した構造を有しており、生体内において様々な生理機能のコントロールに関わる物質である。そして、本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、ＲＮＡを構成する４種のヌクレオチドごとに、光を照射した際の出射光のスペクトル形状が異なることを知見した。 なお、ヌクレオチドとは、塩基に対し、糖及びリン酸が結合した物質である。また、ＲＮＡを構成する各ヌクレオチドは、上述した４種の塩基のヌクレオチドであり、具体的には、アデニル酸（別称：アデノシン－リン酸、Adenosine monophosphate、「ＡＭＰ」）、グアニル酸（別称：グアノシン－リン酸、Guanosine monophosphate、「ＧＭＰ」）、シチジル酸（別称：シチジン－リン酸、Cytidine monophosphate、「ＣＭＰ」）、ウリジル酸（別称：ウリジン－リン酸、Uridine monophosphate、「ＵＭＰ」）の４種である。 上述した知見に関連し、本発明に至るまでのアプローチ及び本発明の実質的な原理について説明する。 図１は、本発明者らの鋭意の実験により採取した、各ヌクレオチド（ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ）についての、透過光に関するスペクトルデータ（波長と透過率の関係を表すスペクトルデータ）である。より具体的に、図１の左上の図は、ＡＭＰの濃度が調整されたサンプル（０．０２５ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．０７５ｍｇ／ｍＬ、及び０．１ｍｇ／ｍＬの４点）について、光を照射し、その応答の一つである透過率のスペクトルを示したものである。また、図１の右上の図は、ＧＭＰの濃度が調整されたサンプル（０．０２５ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．０７５ｍｇ／ｍＬ、及び０．１ｍｇ／ｍＬの４点）について、光を照射し、その応答の一つである透過率のスペクトルを示したものである。また、上記と同様に、図１の左下の図は、ＣＭＰに関する透過率のスペクトルを示したものであり、図１の右下の図は、ＵＭＰに関する透過率のスペクトルを示したものである。図１に示すように、４種のヌクレオチドは、それぞれ固有のスペクトル形状を有していること、また、濃度依存的なピーク強度の変化、ひいては波形の変化を示すことが、本発明者らの実験により確認された。 図２は、ＡＭＰを一例として挙げ、図１に示す透過光のスペクトル（波長と透過率の関係を表すスペクトルデータ）について、ＡＭＰ濃度と透過率の関係を表すデータへとプロットの書き換えを行ったものである。図２より、抽出した波長ごとに、良好な濃度依存性が見られた。また、図示しないが、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰについても、同様に良好な濃度依存性が見られた。 続いて、かかる濃度依存性に基づき、以下の実験を行った。まず、各ヌクレオチド（ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ及びＵＭＰ）の濃度をそれぞれ所定の値（理論値）に調整したヌクレオチド混合物を作製した。次いで、かかるヌクレオチド混合物に光を照射し、その応答の一つである透過率のスペクトルを実測した。この実測した透過率のスペクトルが、ランベルト＝ベールの法則に基づき、所定濃度及び所定のヌクレオチドのスペクトルへと数学的に分離できるものと仮定し、図１に示されるような各スペクトルデータのうちのいずれによって構成されているかについて、演算を行った。そして、かかる演算により、ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ及びＵＭＰの濃度の演算値を得た。また、ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ及びＵＭＰの濃度の値（理論値）を複数通りに変更して調整した上で、上記と同様のスペクトルの実測及び演算を複数行った。 図３は、各ヌクレオチドの濃度の理論値と、上述した複数の演算により得られた濃度の演算値との関係を表すデータである。なお、図３において、全プロット数は２００である（つまり、ヌクレオチド混合物のサンプル数は５０である）。かかるデータから分かる通り、各ヌクレオチドの濃度の演算値が、理論値との良好な相関性を示す結果となった（４種のヌクレオチドのいずれも、決定係数Ｒ２が０．９５７以上であった）。このことから、上述した仮定は実質的に正しいことと判断された。即ち、サンプル中に４種のヌクレオチドが併存していても、各ヌクレオチドの光照射の応答は、他のヌクレオチドの影響が無いか又は極めて小さいものと考えられた。 本発明のヌクレオチド濃度測定方法及びヌクレオチド濃度測定システムは、上述した知見及び実質的な原理に基づき、測定対象サンプル（ＲＮＡ又はヌクレオチド混合物）のスペクトルデータを採取し、かかるスペクトルデータについて演算を行うことで、ＲＮＡを構成する各ヌクレオチドの濃度、又は混合物における各ヌクレオチドの濃度を確認することを可能にするものである。かかる測定方法及び測定システムは、前処理などの煩雑な手順が必須ではなく、また、ＮＭＲなどの大型機器を用いる必要もないため、ＲＮＡを構成する各ヌクレオチドの濃度を簡易的に測定することができる。また、かかる測定方法及び測定システムは、言うまでもなく、各ヌクレオチド（４種のヌクレオチド）の構成比の確認も可能にするものである。 なお、上述の説明では、透過光に関するスペクトルデータを用いたが、用いるスペクトルデータは、光を照射したときの応答（出射光）に関するスペクトルデータであれば、特に限定されない。例えば、透過光に関するスペクトルデータを用いてもよく、反射光に関するスペクトルデータを用いてもよく、又は、その両方を用いてもよい。上述の知見を踏まえれば、理論上、反射光に関するスペクトルデータも良好な濃度依存性が見られ、各ヌクレオチドの濃度の測定を可能にし得るものと考えられる。 また、上述の説明で用いたスペクトルデータは、２００ｎｍ以上３００ｎｍ以下の波長範囲のデータであるが、着目する波長範囲のデータは、濃度依存性が見られる波長範囲であれば、特に限定されない。上述の知見を踏まえれば、理論上、２００ｎｍ以上３００ｎｍ以下の範囲以外の波長範囲のデータも、濃度依存性が見られ、各ヌクレオチドの濃度の測定を可能にし得るものと考えられる。 また、上述の説明では、測定対象サンプルとしてヌクレオチド混合物を用いたが、測定対象サンプルは、ＲＮＡそのものであってもよい。上述の知見を踏まえれば、ＲＮＡを含むサンプルを用いて得られるスペクトルデータは、当該ＲＮＡを（ヌクレアーゼ酵素などによって）あらかじめ分解したヌクレオチドを含むサンプルを用いて得られるスペクトルデータと、実質的に対応し得るものと考えられる。つまり、測定対象サンプルとしてＲＮＡそのものを用いたとしても、当該ＲＮＡを構成する各ヌクレオチドの濃度の測定を可能にし得るものと考えられる。 ＜ヌクレオチド濃度測定方法＞ 本発明の一実施形態に係るヌクレオチド濃度測定方法（以下、「本実施形態の測定方法」）は、上述した原理に基づいた、ＲＮＡを構成する各ヌクレオチド（（ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ））の濃度を測定する方法である。そして、本実施形態の測定方法は、ＲＮＡを含むサンプル又はＲＮＡに由来する各ヌクレオチドを含むサンプルに対して光を照射し、出射光に関する実測スペクトルデータを得る、光照射工程と、前記実測スペクトルデータについて、あらかじめ取得しておいた各ヌクレオチドの濃度ごとの出射光に関する参照スペクトルデータを用いた演算を行うことにより、各ヌクレオチドの濃度を導出する、演算工程と、を少なくとも含む、ことを特徴とする。 （光照射工程） 本実施形態の測定方法において、光照射工程は、ＲＮＡを含むサンプル又はＲＮＡに由来する各ヌクレオチドを含むサンプル（各ヌクレオチドの濃度が未知のサンプル）に対して光を照射し、出射光に関する実測スペクトルデータを得る工程である。 光が照射されるサンプルは、ＲＮＡそのものを含むサンプルであってもよく、ＲＮＡに由来する各ヌクレオチドを含むサンプル、より具体的には、ＲＮＡを（ヌクレアーゼ酵素などによって）あらかじめ分解したヌクレオチドを含むサンプルであってもよい。また、上記サンプルとしては、ＲＮＡ又はＲＮＡに由来する各ヌクレオチドが所定の希釈率で調整されたものを用いてもよい。 サンプルに照射される光としては、特に限定されないが、紫外光（１００ｎｍ以上４００ｎｍ以下の波長範囲の光）、可視光（４００ｎｍ超７８０ｎｍ未満の波長範囲の光）、赤外光（７８０ｎｍ以上１ｍｍ以下の波長範囲の光）、又は、これら紫外光、可視光及び赤外光を含む光が挙げられる。サンプルに照射される光は、特には、２００ｎｍ以上３００ｎｍ以下の波長範囲を含むことが好ましい。 実測スペクトルデータを得る対象の出射光は、透過光であってもよく、反射光であってもよく、透過光及び反射光の両方であってもよい。 光照射工程における光照射の条件は、あらかじめ参照スペクトルデータ（後述）を取得する際の光照射の条件と、実質的に同一であることが好ましい。 出射光に関する実測スペクトルデータの取得は、常法に従って行うことができる。例えば、分光光度計等の装置を用い、実測スペクトルデータを取得することができる。 （演算工程） 本実施形態の測定方法において、演算工程は、光照射工程で得られた実測スペクトルデータについて、あらかじめ取得しておいた各ヌクレオチドの濃度ごとの出射光に関する参照スペクトルデータを用いた演算を行う工程である。 あらかじめ取得しておいた「各ヌクレオチドの濃度ごとの出射光に関する参照スペクトルデータ」とは、要するに、図１に示されるようなスペクトルデータである。例えば図１には、４（ヌクレオチドの種類）×４（濃度）＝１６個の参照スペクトルデータ（透過光に関するスペクトルデータ）