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JP-2026077678-A - 酵素補充療法用酵素を含む融合タンパク質

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Abstract

【課題】酵素補充療法用酵素を含む融合タンパク質の提供。 【解決手段】本発明で提供するのは、酵素補充療法用酵素及びＦｃ領域を含む融合タンパク質、ならびにそのようなタンパク質を用いて、リソソーム蓄積障害を治療する方法である。本発明では、血液脳関門を越えて、薬剤を輸送する方法も提供する。いくつかの態様では、本発明で提供するのは、（ａ）ＥＲＴ用酵素、ＥＲＴ用酵素バリアントまたはその触媒活性断片に連結されている第１のＦｃポリペプチド、及び（ｂ）第１のＦｃポリペプチドとＦｃ二量体を形成する第２のＦｃポリペプチドを含むタンパク質である。 【選択図】なし

Inventors

  • ジュゼッペ アスタリタ
  • ジュンファ ワン
  • ジョイ ユー ズッチェロ
  • マーク エス． デニス
  • ジェニファー エー． ゲッツ
  • アナスタシア ヘンリー
  • ミハリス カリオリス
  • カタル マホーン
  • アダム ピー． シルバーマン
  • アンキタ スリバスタバ
  • ジュリー ウルマン

Assignees

  • デナリ セラピューティクス インコーポレイテッド

Dates

Publication Date
20260513
Application Date
20260206
Priority Date
20171002

Claims (1)

  1. 図面に記載の発明。

Description

関連出願の相互参照 本願は、２０１７年１０月２日に提出された米国特許仮出願第６２／５６６，８９８号、２０１７年１１月８日に提出された米国特許仮出願第６２／５８３，２７６号、２０１８年２月５日に提出された米国特許仮出願第６２／６２６，３６５号、２０１８年５月３０日に提出された米国特許仮出願第６２／６７８，１８３号及び２０１８年８月２２日に提出された米国特許仮出願第６２／７２１，３９６号（それらの開示内容は、参照により、あらゆる目的で、その全体が本明細書に援用される）に基づく優先権を主張するものである。 配列表 本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出したとともに、参照により、その全体が本明細書に援用される配列表を含む。２０１８年９月２８日に作成した前記ＡＳＣＩＩコピーは、１０２３４２－０００３５０ＰＣ－１１０３９４９＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、５８０，４６４バイトのサイズである。 リソソーム蓄積障害（ＬＳＤ）は、リソソーム機能の異常に起因する比較的希少な遺伝性代謝疾患である。ＬＳＤは典型的には、リソソームにおける代謝産物の分解に関与する１つの酵素の欠損を原因とする。酵素活性の欠損により、代謝産物が蓄積すると、様々な器官系に影響が及び、重篤な症状が生じて早期に死亡し得る。ＬＳＤの大半では、進行性神経変性及び重度の認知機能障害から、てんかん性障害、行動障害及び精神障害までに及ぶ顕著な神経的要素も見られる。ＬＳＤにおいて欠損している酵素の組み換え型を用いて、ＬＳＤを治療できるが、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えて組み換え酵素を送達するのは困難であるために、そのような療法には、脳に対する作用があまりない場合がある。 イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）酵素に連結されているＦｃポリペプチド、及びトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合する改変Ｆｃポリペプチドを含むＩＤＳ－Ｆｃ融合タンパク質の精製及び解析結果を示している。図１で解析したＩＤＳ－Ｆｃ融合タンパク質に対する結合親和性アッセイの結果を示しており、その融合タンパク質がＴｆＲに結合することを証明している。図１で解析したＩＤＳ－Ｆｃ融合タンパク質のインビトロＩＤＳ活性を示すデータを示している。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイを用いて評価したところ、ＩＤＳが欠損しているノックアウト細胞において、ヘパラン硫酸由来の二糖のレベルが上昇していたとともに、ＩＤＳノックアウト（ＫＯ）細胞におけるＩＤＳの発現によって、ノックアウト表現型がレスキューされることを示すデータを提供している。Ａは、同じＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド（すなわちＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７）を含むＮ末端モノザイムまたはＣ末端モノザイムのいずれかとしてのＩＤＳ－Ｆｃ融合タンパク質が、ＩＤＳ ＫＯ細胞におけるヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の蓄積を逆転させることを示している。Ｂは、Ｎ末端モノザイム（「ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２１．１７」）が、ＩＤＳに相当する細胞有効性を有することを示している。Ｃは、ＩＤＳ－Ｆｃ融合タンパク質（「ＥＴＶ：ＩＤＳ」）またはＩＤＳで処置したＭＰＳ ＩＩ患者の線維芽細胞（ｎ＝８）において、Ｓ３５－硫酸標識タンパク質の蓄積が用量依存的に低減されたことが示されている。Ｄは、５ｍＭのＭ６Ｐの存在下または非存在下で、漸増濃度のＩＤＳ－Ｆｃ融合タンパク質（「ＥＴＶ：ＩＤＳ」）またはＩＤＳで処置したＭＰＳ ＩＩ患者の線維芽細胞（ｎ＝３）におけるＳ３５標識タンパク質のＭ６ＰＲ依存的クリアランスの評価を示している。図５Ｃ～５Ｄでは、「ＥＴＶ：ＩＤＳ」は、ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２３．２であり、グラフには、反復実験にわたる平均値±標準誤差が示されている。Ａは、同じＴｆＲ結合Ｆｃポリペプチド（すなわちＣＨ３Ｃ．３５．２１．１７）を含むＮ末端モノザイムまたはＣ末端モノザイムのいずれかとしてのＩＤＳ－Ｆｃ融合タンパク質が、ＩＤＳ ＫＯ細胞におけるヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の蓄積を逆転させることを示している。Ｂは、Ｎ末端モノザイム（「ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２１．１７」）が、ＩＤＳに相当する細胞有効性を有することを示している。Ｃは、ＩＤＳ－Ｆｃ融合タンパク質（「ＥＴＶ：ＩＤＳ」）またはＩＤＳで処置したＭＰＳ ＩＩ患者の線維芽細胞（ｎ＝８）において、Ｓ３５－硫酸標識タンパク質の蓄積が用量依存的に低減されたことが示されている。Ｄは、５ｍＭのＭ６Ｐの存在下または非存在下で、漸増濃度のＩＤＳ－Ｆｃ融合タンパク質（「ＥＴＶ：ＩＤＳ」）またはＩＤＳで処置したＭＰＳ ＩＩ患者の線維芽細胞（ｎ＝３）におけるＳ３５標識タンパク質のＭ６ＰＲ依存的クリアランスの評価を示している。図５Ｃ～５Ｄでは、「ＥＴＶ：ＩＤＳ」は、ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２３．２であり、グラフには、反復実験にわたる平均値±標準誤差が示されている。ビヒクルを投与した野生型（ＷＴ）マウス、またはＩＤＳもしくはＩＤＳ－Ｆｃ融合タンパク質（「ＥＴＶ：ＩＤＳ」）を投与したＩＤＳ ＫＯマウスに由来する血清中のヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸のレベルを経時的に示すデータを示している。「ＥＴＶ：ＩＤＳ」は、ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２１である。４０ｍｇ／ｋｇのＩＤＳ－Ｆｃ融合タンパク質（「ＥＴＶ：ＩＤＳ」）または５．３ｍｇ／ｋｇのＩＤＳを１回静脈内注射で投与してから７日後に、ＩＤＳ ＫＯマウスに由来する末梢組織中の二糖Ｄ０ＳＯ、ＤＯＡ０及びＤ０ａ４の合計レベル（「総ｓＧＡＧレベル」という）を評価し、ビヒクルで処置したＩＤＳ ＫＯマウス及び野生型マウス（ＩＤＳ ＫＯ群は、ｎ＝８、野生型群は、ｎ＝３）と比較したものを示すデータを示している。データは、平均±標準誤差として示されており、ｐ値は、ダネットの多重比較検定を伴う一元ＡＮＯＶＡによるものであり、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１である。「ＥＴＶ：ＩＤＳ」は、ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２１である。ＩＤＳ－Ｆｃ融合タンパク質ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２１、またはＴｆＲへの結合をもたらす変異を有さないコントロールＩＤＳ－Ｆｃ融合タンパク質（「ＩＤＳ：Ｆｃ」）を末梢投与した後のヒトＴｆＲノックイン（ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩ）マウスの脳内のＩＤＳ－Ｆｃ融合タンパク質の濃度を示すデータを示している。Ａは、ＩＤＳ－Ｆｃ融合タンパク質ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２１．１７．２もしくはＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２３．２、またはＴｆＲへの結合をもたらす変異を有さないコントロールＩＤＳ－Ｆｃ融合タンパク質（「ＩＤＳ：Ｆｃ」）を末梢投与した後のＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスの脳内のＩＤＳ－Ｆｃ融合タンパク質の濃度を示すデータを示している。Ｂは、５０ｍｇ／ｋｇの用量で１回静脈内注射した後のＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおけるＩＤＳ－Ｆｃ融合タンパク質ＥＴＶ：ＩＤＳ３５．２１またはＩＤＳ：Ｆｃの肝臓中濃度を示すデータを示している（ｎ＝４～５）。グラフには、平均±標準誤差が示されている。Ａ～Ｃは、ＥＴＶ：ＩＤＳが、ＩＤＳ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスの脳及び末梢組織内のＧＡＧを低減することを示している。実施例２に記載されているように、ＩＤＳ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのＥＴＶ：ＩＤＳまたは１４．２ｍｇ／ｋｇのＩＤＳを単回静脈内注射によって投与したか、または週に１回の投与を４回行った。単回投与後のＩＤＳ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおいて、血清（Ａ）及び組織（Ｂ）中のＩＤＳの濃度を測定した。投与から２時間後の組織中ＰＫが示されている（ｎ＝４）。グラフには、平均±標準誤差が示されており、ｐ値は、独立ｔ検定解析によるものである。Ｃは、ＩＤＳ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスの脳、ＣＳＦ及び末梢組織内の二糖Ｄ０ＳＯ、ＤＯＡ０及びＤ０ａ４のレベル（「総ｓＧＡＧレベル」）であって、ＥＴＶ：ＩＤＳまたはＩＤＳを単回投与または複数回投与した後に測定し、ビヒクルで処置した場合及び野生型マウスと比較したレベルを示している（ＩＤＳ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩ群は、ｎ＝８であり、野生型群は、ｎ＝５である）。グラフには、平均±標準誤差が示されており、ｐ値は、ダネットの多重比較検定を伴う一元ＡＮＯＶＡによるものであり、＊＊はｐ＜０．０１であり、＊＊＊はｐ≦０．００１であり、＊＊＊＊はｐ≦０．０００１である。Ａ～Ｃは、ＥＴＶ：ＩＤＳが、ＩＤＳ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスの脳及び末梢組織内のＧＡＧを低減することを示している。実施例２に記載されているように、ＩＤＳ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのＥＴＶ：ＩＤＳまたは１４．２ｍｇ／ｋｇのＩＤＳを単回静脈内注射によって投与したか、または週に１回の投与を４回行った。単回投与後のＩＤＳ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおいて、血清（Ａ）及び組織（Ｂ）中のＩＤＳの濃度を測定した。投与から２時間後の組織中ＰＫが示されている（ｎ＝４）。グラフには、平均±標準誤差が示されており、ｐ値は、独立ｔ検定解析によるものである。Ｃは、ＩＤＳ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスの脳、ＣＳＦ及び末梢組織内の二糖Ｄ０ＳＯ、ＤＯＡ０及びＤ０ａ４のレベル（「総ｓＧＡＧレベル」）であって、ＥＴＶ：ＩＤＳまたはＩＤＳを単回投与または複数回投与した後に測定し、ビヒクルで処置した場合及び野生型マウスと比較したレベルを示している（ＩＤＳ ＫＯ×ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩ群は、ｎ＝８であり、野生型群は、ｎ＝５である）。グラフには、平均±標準誤差が示されており、ｐ値は、ダネットの多重比較検定を伴う一元ＡＮＯＶＡによるものであり、＊＊はｐ＜０．０１であり、＊＊＊はｐ≦０．００１であり、＊＊＊＊はｐ≦０．０００１である。２つの酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）酵素に連結されているＦｃ領域を含むＡＳＭ－Ｆｃ融合タンパク質の精製及び解析結果を示している。図１１で解析したＡＳＭ－Ｆｃ融合タンパク質のインビトロでのＡＳＭ活性を示すデータを示している。イメージングベースのアッセイを用いて、図１１で解析したようなＡＳＭ－Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＳＭ ＫＯ細胞におけるスフィンゴミエリンの蓄積を低減することを示すデータを示している。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳベースのアッセイを用いて、図１１で解析したようなＡＳＭ－Ｆｃ融合タンパク質が、ＡＳＭ ＫＯ細胞におけるスフィンゴミエリンの蓄積を低減することを示すデータを示している。実施例６に記載されているＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質のインビトロでのＮ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）活性を示すデータを示している。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイを用いて評価したところ、ＳＧＳＨが欠損しているノックアウト（ＫＯ）細胞において、ヘパラン硫酸由来の二糖のレベルが上昇していたことを示すデータを示している。ｎ＝３～４個の独立した細胞株であり、データは、平均±標準誤差として示されている。図１５で解析したＳＧＳＨ－Ｆｃ融合タンパク質が、ＳＧＳＨ ＫＯ細胞におけるヘパラン硫酸の蓄積を逆転させることを示すデータを示している。ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおける、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチドのｈＴｆＲ親和性と脳暴露の経時的な関係を示している。点は、ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおいて５０ｍｇ／ｋｇを１回投与した後の、様々な操作されたＴｆＲ結合ポリペプチドの親和性バリアントの経時的な累積脳暴露（ＡＵＣ）を表している。投与からの様々な経過日数（１～１０日の範囲）に、ポリペプチドの脳内濃度（ｈｕＩｇＧ１によって測定した）を算出した。データは、３回の独立した試験をまとめたものであり、各試験の各群のマウス数は、４～５頭である。ＴｆＲｍｓ／ｈｕ ＫＩマウスにおける、操作されたＴｆＲ結合ポリペプチドのｈＴｆＲ親和性と、最高脳内濃度の関係を示している。点は、５０ｍｇ／ｋｇの用量を１回投与してから１日目に