JP-2026077681-A - 操作された重鎖可変領域を有する齧歯類
Abstract
【課題】操作された重鎖可変領域を有する齧歯類を提供する。 【解決手段】一部の実施形態では、非ヒト動物であって、そのゲノム、例えば、生殖細胞系ゲノムが、操作されたＤ Ｈ 領域を含むイムノグロブリン重鎖可変領域を備え、該操作されたＤ Ｈ 領域は一つ以上のヌクレオチド配列を含み、その配列の各々が対象の非イムノグロブリンポリペプチドまたはその一部をコードする、該非ヒト動物が提供されている。一部の実施形態では、非ヒト動物を作製するための、本明細書に記載の非ヒト胚性幹細胞または生殖細胞の使用が提供される。 【選択図】図１Ａ
Inventors
- リン マクドナルド
- ジョン マクウィルター
- アンドリュー ジェイ． マーフィー
Assignees
- リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
Dates
- Publication Date
- 20260513
- Application Date
- 20260206
- Priority Date
- 20160113
Claims (1)
- 明細書に記載の方法。
Description
抗体ベースの治療薬は、一部の疾患の治療に極めて有望である。モノクローナル型、マウス型、キメラ化、ヒト化、ヒト型、完全長型、Ｆａｂ型、ペグ化、放射標識型、薬剤抱合型、多特異型などを含めた種々のフォーマットが開発されている（例えば、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ，Ｊ．Ｍ．，２０１２，ｍＡｂｓ ４：３，４１３－４１５；Ｎｉｘｏｎ，Ａ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，ｍＡｂｓ ６：１，７３－８５を参照されたく、これらの文献は参照により本明細書に援用される）。米国またはヨーロッパで販売承認を受けた４０種類を超える治療抗体薬剤のうちの全てが、ヒトおよび／または非ヒト（例えば、マウス）を供給源とする通例の抗体遺伝子をインビトロ（例えば、ファージディスプレイ）システムまたはインビボ（例えば、遺伝子操作動物）システムでアセンブリすることに依拠した技術を用いて、作製されてきた。だが、難治性の標的を結合させる特に効果的な抗体薬剤の開発には、未だ課題が残ったままである。 Ｒｅｉｃｈｅｒｔ，Ｊ．Ｍ．，２０１２，ｍＡｂｓ ４：３，４１３－４１５Ｎｉｘｏｎ，Ａ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，ｍＡｂｓ ６：１，７３－８５ 体細胞超変異ホットスポットを含めるように、選択されたＤ６ケモカインデコイ受容体コード配列を最適化した例を示す。図１Ａ：天然（破線塗りつぶし）および人工（斜線塗りつぶし）のＲＧＹＷ活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）ホットスポットの位置を含めたＤ６ケモカインデコイ受容体の最適化されたＮ末端（Ｎｔｅｒｍ）ドメイン；図１Ｂ：天然（破線塗りつぶし）および人工（斜線塗りつぶし）のＲＧＹＷ活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）ホットスポットの位置を含めたＤ６ケモカインデコイ受容体の最適化されたＥＣ１ドメイン；図１Ｃ：天然（破線塗りつぶし）および人工（斜線塗りつぶし）のＲＧＹＷ ＡＩＤホットスポットの位置を含めたＤ６ケモカインデコイ受容体の最適化されたＥＣ２ドメイン；図１Ｄ：天然（破線塗りつぶし）および人工（斜線塗りつぶし）のＲＧＹＷ ＡＩＤホットスポットの位置を含めたＤ６ケモカインデコイ受容体の最適化されたＥＣ３ドメイン。同上。同上。同上。同上。 各ヌクレオチドコード配列に対して、Ｖ（Ｄ）Ｊ組み換えの間にヌクレオチドコード配列の効率的な組み換え頻度と均等な使用とを可能にするように設計された、最適化された５’および３’組み換えシグナル配列（ＲＳＳ）の例を表す表を示す。グローバルＲＳＳコンセンサス５’ＲＳＳ（配列番号５１）；グローバルＲＳＳコンセンサス３’ＲＳＳ（配列番号５２）；ヒトＤＨコンセンサス５’ＲＳＳ（配列番号５３）；ヒトＤＨコンセンサス３’ＲＳＳ（配列番号５４）；マウスＤＨコンセンサス５’ＲＳＳ（配列番号５５）；マウスＤＨコンセンサス３’ＲＳＳ（配列番号５６）；最適化されたＲＳＳ５’ＲＳＳ（配列番号５７）；最適化されたＲＳＳ３’ＲＳＳ（配列番号５８）；１－１ ｏｐｔ ５’ＲＳＳ（配列番号５９）；１－１ ｏｐｔ ３’ＲＳＳ（配列番号６０）；１－７ ｏｐｔ ５’ＲＳＳ（配列番号６１）；１－７ ｏｐｔ ３’ＲＳＳ（配列番号６２）；１－１４ ＯＲＦ ｏｐｔ ５’ＲＳＳ（配列番号６３）；１－１４ ＯＲＦ ｏｐｔ ３’ＲＳＳ（配列番号６４）；１－２０ ｏｐｔ ５’ＲＳＳ（配列番号６５）；１－２０ ｏｐｔ ３’ＲＳＳ（配列番号６６）；１－２６ ｏｐｔ ５’ＲＳＳ（配列番号６７）；１－２６ ｏｐｔ ３’ＲＳＳ（配列番号６８）；２－２＊０２ ｏｐｔ ５’ＲＳＳ（配列番号６９）；２－２＊０２ ｏｐｔ ３’ＲＳＳ（配列番号７０）；２－８＊０１ ｏｐｔ ５’ＲＳＳ（配列番号７１）；２－８＊０１ ｏｐｔ ３’ＲＳＳ（配列番号７２）；２－１５ ｏｐｔ ５’ＲＳＳ（配列番号７３）；２－１５ ｏｐｔ ３’ＲＳＳ（配列番号７４）；２－２１＊０２ ｏｐｔ ５’ＲＳＳ（配列番号７５）；２－２１＊０２ ｏｐｔ ３’ＲＳＳ（配列番号７６）；３－３＊０１ ｏｐｔ ５’ＲＳＳ（配列番号７７）；３－３＊０１ ｏｐｔ ３’ＲＳＳ（配列番号７８）；３－９ ｏｐｔ ５’ＲＳＳ（配列番号７９）；３－９ ｏｐｔ ３’ＲＳＳ（配列番号８０）；３－１０＊０１ ｏｐｔ ５’ＲＳＳ（配列番号８１）；３－１０＊０１ ｏｐｔ ３’ＲＳＳ（配列番号８２）；３－１６＊０２ ｏｐｔ ５’ＲＳＳ（配列番号８３）；３－１６＊０２ ｏｐｔ ３’ＲＳＳ（配列番号８４）；３－２２ ｏｐｔ ５’ＲＳＳ（配列番号８５）；３－２２ ｏｐｔ ３’ＲＳＳ（配列番号８６）；４－４ ｏｐｔ ５’ＲＳＳ（配列番号８７）；４－４ ｏｐｔ ３’ＲＳＳ（配列番号８８）；４－１１ ＯＲＦ ｏｐｔ ５’ＲＳＳ（配列番号８９）；４－１１ ＯＲＦ ｏｐｔ ３’ＲＳＳ（配列番号９０）；４－１７ ｏｐｔ ５’ＲＳＳ（配列番号９１）；４－１７ ｏｐｔ ３’ＲＳＳ（配列番号９２）；４－２３ ｏｐｔ ５’ＲＳＳ（配列番号９３）；４－２３ ｏｐｔ ３’ＲＳＳ（配列番号９４）；５－５ ｏｐｔ ５’ＲＳＳ（配列番号９５）；５－５ ｏｐｔ ３’ＲＳＳ（配列番号９６）；５－１２ ｏｐｔ ５’ＲＳＳ（配列番号９７）；５－１２ ｏｐｔ ３’ＲＳＳ（配列番号９８）；５－１８ ｏｐｔ ５’ＲＳＳ（配列番号９９）；５－１８ ｏｐｔ ３’ＲＳＳ（配列番号１００）；５－２４ ｏｐｔ ５’ＲＳＳ（配列番号１０１）；５－２４ ｏｐｔ ３’ＲＳＳ（配列番号１０２）；６－６ ｏｐｔ ５’ＲＳＳ（配列番号１０３）；６－６ ｏｐｔ ３’ＲＳＳ（配列番号１０４）；６－１３ ｏｐｔ ５’ＲＳＳ（配列番号１０５）；６－１３ ｏｐｔ ３’ＲＳＳ（配列番号１０６）；６－１９ ｏｐｔ ５’ＲＳＳ（配列番号１０７）；６－１９ ｏｐｔ ３’ＲＳＳ（配列番号１０８）；６－２５（最適化されていない）５’ＲＳＳ（配列番号１０９）；６－２５（最適化されていない）３’ＲＳＳ（配列番号１１０）；７－２７（最適化されていない）５’ＲＳＳ（配列番号１１１）；７－２７（最適化されていない）３’ＲＳＳ（配列番号１１２）。グローバルＲＳＳコンセンサスおよび７－２７の太字およびイタリック体のフォントは、イムノグロブリンおよびＴ細胞受容体のＶ、Ｄ、Ｊ遺伝子セグメント由来の齧歯類およびヒトのＲＳＳに基づくグローバルＲＳＳコンセンサス配列への一致を示し；マウスＤＨコンセンサスの太字フォントは、マウスイムノグロブリンＤＨコンセンサス配列への一致を示し；ヒトＤＨコンセンサス、最適化されたＲＳＳ、および残り全てのＲＳＳ（例えば、１－１ ｏｐｔ、１－７ ｏｐｔ、１－２０ ｏｐｔなど）の太字フォントは、ヒトイムノグロブリンＤＨコンセンサス配列への一致を示す。 齧歯類であって、そのゲノムが、操作された多様性クラスター（すなわち、ＤＨ領域）を含むイムノグロブリン重鎖可変領域を備え、該多様性クラスターは一つ以上のヌクレオチド配列を含み、その配列の各々が非イムノグロブリンポリペプチド（例えば、Ｄ６ケモカインデコイ受容体の細胞外部分）をコードする、該齧歯類を作製するために、齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞への組み込み用の標的化ベクターを構築するための戦略の例を示す図（等尺度ではない）である。図３Ａ：四つの初期段階の表示（１）Ｄ６コード配列のデノボ合成、（２）選択カセット（例えば、ネオマイシン）およびＤ６ ＤＮＡ断片のＡｇｅＩ／ＥｃｏＲＩ消化およびライゲーション、（３）Ｄ６ ＤＮＡ断片のＳｎａＢＩ消化およびＢＡＣベクター（ｐＢａｃＥ３．６）のＮｏｔＩ／ＡｓｃＩ消化、（４）通例のＤＨセグメントの代わりに、Ｄ６ケモカインデコイ受容体コード配列の操作された隣接する多様性クラスターを作製するための、消化されたＤＮＡ断片の一段階の等温アセンブリ；図３Ｂ：齧歯類ＥＳ細胞のゲノムへの組み込み用の標的化ベクターを作製する追加段階、（５）ヒトイムノグロブリンＶＨＤＮＡおよびＪＨＤＮＡをそれぞれ含有する５’相同性アームおよび３’相同性アームを付加するための、ＢＡＣクローン内への２５個の合成Ｄ６ケモカインデコイ受容体コード配列のＰＩ－ＳｃｅＩ／Ｉ－ＣｅｕＩ消化およびライゲーション。種々の制限酵素認識部位が、図示したＤＮＡ断片の各々に対して表示されている。ｌｐ：ｌｏｘＰ部位；ｎｅｏ：ユビキチンプロモーターによって駆動するネオマイシン選択カセット；ｃｍ：クロラムフェニコール選択カセット；ｆｒｔ：フリッパーゼ認識標的配列；ｈｙｇ：ハイグロマイシン選択カセット；Ｅｉ：マウス重鎖イントロンエンハンサー；ＩｇＭ：マウスイムノグロブリンＭ定常領域遺伝子；ｌｏｘ：ｐＢＡＣｅ３．６ベクターのｌｏｘＰ部位配列。同上。 齧歯類であって、そのゲノムが、操作された多様性クラスター（すなわち、操作されたＤＨ領域）を含むイムノグロブリン重鎖可変領域を備え、該多様性クラスターは一つ以上のヌクレオチド配列を含み、その配列の各々がＤ６ケモカインデコイ受容体の細胞外部分をコードする、該齧歯類を作製するために、齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞への組み込み用の標的化ベクターを構築するための連続ライゲーションで、Ｄ６ケモカインデコイ受容体コード配列をアセンブルする戦略の代替例を示す図（等尺度ではない）である。図４Ａ：四つの初期段階の表示（１）Ｄ６コード配列のデノボ合成、（２）選択カセット（例えば、ネオマイシン）およびＤ６ ＤＮＡ断片のＡｇｅＩ／ＥｃｏＲＩ消化およびライゲーション、（３）Ｄ６ ＤＮＡ断片のＢＡＣベクター（ｐＢａｃＥ３．６）へのＮｏｔＩ／ＡｓｃＩ消化およびライゲーション、（４）Ｄ６断片のＢＡＣベクター骨格へのＰａｃＩ／Ｎｓｉ消化およびライゲーション；図４Ｂ：齧歯類ＥＳ細胞のゲノムへの組み込み用の標的化ベクターを作製する二つの追加段階、（５）追加のＤ６ ＤＮＡ断片のＢＡＣベクター骨格へのＰＩ－ＳｃｅＩ／Ｉ－ＣｅｕＩ消化およびライゲーション、（６）ＢＡＣベクター骨格内に２５個の合成Ｄ６ケモカインデコイ受容体コード配列を作製するための最終Ｄ６ ＤＮＡ断片のＮｓｉＩ／Ｉ－ＣｅｕＩ消化およびライゲーション。種々の制限酵素認識部位が、図示したＤＮＡ断片の各々に対して表示されている。ｌｐ：ｌｏｘＰ部位配列；ｎｅｏ：ユビキチンプロモーターによって駆動するネオマイシン選択カセット；ｃｍ：クロラムフェニコール選択カセット。同上。 ＴＡＱＭＡＮＴＭおよび核型分析によってスクリーニングされた、エレクトロポレーション後の薬剤耐性コロニーの遺伝物質を用いたスクリーニング戦略の例を示す。種々のプライマー／プローブセット（表７を参照のこと）の名称とおよその位置（楕円によって囲われた線、等尺度ではない）が、表示された種々のアレルの下に示されている（等尺度ではない）。ｈｙｇ：ユビキチンプロモーターにより駆動するハイグロマイシン選択カセット；ｎｅｏ：ユビキチンプロモーターにより駆動するネオマイシン選択カセット；Ｌ：ｌｏｘＰ部位配列；Ｆｒｔ：フリッパーゼ認識標的配列。 体細胞超変異ホットスポットを含めるように、選択されたμ－コノトキシンおよびタランチュラ毒素のコード配列を最適化した例を示す。図６Ａ：人工（斜線塗りつぶし）ＲＧＹＷ活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）ホットスポットの位置を含めたμ－コノトキシンの最適化されたＫＩＩＩＡ ｆｌ；図６Ｂ：人工（斜線塗りつぶし）ＲＧＹＷ活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）ホットスポットの位置を含めたμ－コノトキシンの最適化されたＫＩＩＩＡ ｍｉｎｉ（上側）およびＫＩＩＩＡ ｍｉｄｉ（下側）；図６Ｃ：人工（斜線塗りつぶし）ＲＧＹＷ ＡＩＤホットスポットの位置を含めたμ－コノトキシンの最