JP-2026077682-A - 遺伝性障害のための遺伝子発現を改変するための方法

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Abstract

【課題】遺伝性障害のための遺伝子発現を改変するための方法の提供。【解決手段】レアカッティングエンドヌクレアーゼおよびトランスポザーゼを使用して、内因性遺伝子の発現を修飾する、または内因性遺伝子のコード配列を修飾するための方法および組成物。一態様では、本明細書に記載の方法は、機能獲得障害を治療するための新規なアプローチを提供し、病原性アレル（複数可）および非病原性アレル（複数可）がサイレンシングされ、タンパク質発現がサイレンシング耐性のコード配列を使用して置き換えられる。【選択図】なし

Inventors

ニコラスバルテス

Assignees

ブルーアレル，エルエルシー

Dates

Publication Date: 20260513
Application Date: 20260206
Priority Date: 20181101

Claims (5)

導入遺伝子と、内因性遺伝子内のイントロンを標的とする少なくとも１つのレアカッティングエンドヌクレアーゼとを含む組み合わせ物であって、前記組み合わせ物は、前記導入遺伝子を前記内因性遺伝子内に組み込むためのものであり、前記導入遺伝子は、５’から３’に：ｉ．スプライスアクセプター配列と、ｉｉ．部分コード配列と、ｉｉｉ．ターミネーターと、ｉｖ．前記内因性遺伝子の発現をサイレンシングするための１つのＲＮＡ干渉カセットとを含み、それにより、前記導入遺伝子が前記内因性遺伝子内に組み込まれ、前記部分コード配列は、前記内因性遺伝子のプロモーターと作動可能に連結され、かつ、前記ＲＮＡ干渉カセットによるサイレンシングに耐性である、組み合わせ物。
前記レアカッティングエンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼである、請求項１に記載の組み合わせ物。
前記レアカッティングエンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである、請求項２に記載の組み合わせ物。
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項３に記載の組み合わせ物。
前記内因性遺伝子が、ＳＯＤ１、ＴＲＰＶ４、ＣＨＲＮＡ１、ＣＨＲＮＤ、ＣＨＲＮＥ、ＣＨＲＮＢ１、ＰＲＰＳ１、ＬＲＲＫ２、ＳＴＩＭ１、ＦＧＦＲ３、ＭＥＣＰ２、ＳＮＣＡ、ＡＴＸＮ１、ＡＴＸＮ２、ＡＴＸＮ３、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＡＴＸＮ７、ＴＢＰ、ＨＴＴ、ＡＲ、ＦＸＮ、ＤＭＰＫ、ＰＡＢＰＮ１、ＡＴＸＮ８、ＲＨＯ、またはＣ９ｏｒｆ７２である、請求項１に記載の組み合わせ物。

Description

関連出願の参照本出願は、先の出願および同時係属出願である２０１８年１１月１日に出願されたＵＳＳＮ６２／７５４，５４８、２０１８年１１月５日に出願されたＵＳＳＮ６２／７５５，７５５、２０１８年１１月６日に出願されたＵＳＳＮ６２／７５６，１７５、および２０１９年１月３１日に出願されたＵＳＳＮ６２／７９９，６１５に対する優先権を主張し、これらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。配列表本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に援用される。当該ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年１０月２９日に作成されたＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ＿ＢＡ２０１８－５＿Ｐ１２９８８という名前で、５０７，９０４バイトのサイズである。本文書は、ゲノム編集および遺伝子治療の分野である。より具体的には、本文書は、内因性遺伝子の標的化修飾、または導入遺伝子からの遺伝子発現と共に内因性遺伝子発現の低減に関する。単一遺伝子障害（ｍｏｎｏｇｅｎｉｃｄｉｓｏｒｄｅｒ）は、その例としては鎌状赤血球症（ヘモグロビン－β遺伝子）、嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜貫通伝導調節因子遺伝子）、およびテイ・サックス病（β－ヘキソサミニダーゼＡ遺伝子）が挙げられる、単一の遺伝子における１つ以上の変異によって引き起こされる。単一遺伝子障害は、欠陥遺伝子を機能性コピーで置き換えることが治療上の利益をもたらす可能性があるため、遺伝子治療に対する関心が高まってきた。しかしながら、効果的な療法を生み出す上での１つの妨げとしては、遺伝子の機能性コピーのサイズが挙げられる。ウイルスを使用するものを含む多くの送達方法には、サイズ制限があり、大きな導入遺伝子の送達を妨げる。さらに、多くの遺伝子は、複数のタンパク質をコードする単一の遺伝子をもたらす、選択的スプライシングパターンを有する。欠陥遺伝子の領域を修正する方法は、単一遺伝子障害を治療するための追加の手段を提供し得る。内因性遺伝子への標的化挿入および５’末端の修復のための例示的な導入遺伝子の図である。ＴＳ１：標的部位１、ＳＤ１：スプライスドナー部位１、ＣＤＳ１：コード配列１、Ｐ１：プロモーター１、ＴＳ２：標的部位２、ＳＤ２：スプライスドナー部位２、ＣＤＳ２：コード配列２、Ｐ２：プロモーター２、ＨＡ１：相同アーム１、ＨＡ２：相同アーム２、Ｔ１：ターミネーター１、Ｔ２：ターミネーター２、ＡＳ１：追加配列１、ＡＳ２：追加配列２。例示的な遺伝子のイントロンへの導入遺伝子の組み込みを示す図である。導入遺伝子は、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの２つの標的部位、２つのスプライスドナー配列、２つのコード配列（１．１および１．２）、ならびに２つのプロモーターを含む。組み込みは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して進行する。ＡＴＧ：開始コドン、ＴＡＡ：停止コドン例示的な遺伝子への導入遺伝子の組み込みを示す図である。導入遺伝子は、２つの相同アーム、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの２つの標的部位、２つのスプライスドナー配列、２つのコード配列（１．１および１．２）、ならびに２つのプロモーターを含む。組み込みは、相同組換え（ＨＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）のいずれかを介して進行する。導入遺伝子の例示的な遺伝子への組み込みを示す図である。導入遺伝子は、２つの相同アーム、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの２つの標的部位、２つのスプライスドナー配列、２つのコード配列（１．１および１．２）、ならびに２つのプロモーターを含む。組み込みは、相同組換え（ＨＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）のいずれかを介して進行する。本明細書に記載の導入遺伝子の組み込み後に産生される遺伝子産物の図である。導入遺伝子内の第１および第２の部分コード配列が内因性遺伝子のコード配列と相同である場合、ＲＮＡヘアピンおよびｄｓＲＮＡが形成され得る（上）。内因性遺伝子のコード配列との相同性を低減させて、第１および第２の部分コード配列をコドン調整した場合、ＲＮＡ対合が低減され得る（下）。Ｔ１：転写産物１、Ｔ２：転写産物２、Ｔ３：転写産物３、＋１：ＲＮＡ合成開始部位、Ｓ：センス、ＡｎｔｉＳ：アンチセンス。ＡＴＸＮ２遺伝子のエキソン１～３の図である。ＡＴＸＮ２遺伝子に組み込むためのｐＢ１０１２－Ｄ１およびｐＢＡ１１４１の導入遺伝子も示されている。ＡＴＸＮ２遺伝子内のｐＢ１０１２－Ｄ１またはｐＢＡ１１４１の導入遺伝子の組み込み結果の図である。例示的な遺伝子のエキソンへの導入遺伝子の組み込みを示す図である。導入遺伝子は、２つの相同アーム、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの２つの標的部位、２つのスプライスドナー配列、２つのコード配列（１．１および１．２）、ならびに２つのプロモーターを含む。組み込みは、相同組換え（ＨＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）のいずれかを介して進行する。サイレンシング配列およびサイレンシング耐性コード配列を含む導入遺伝子の図である。２つのシナリオが示される。シナリオ１は、ＷＴタンパク質の置換物を産生しながら、内因性遺伝子の両方のアレルをサイレンシングするためのアプローチを示す図である。シナリオ２は、タンパク質の置換物を産生しながら、２つのアレルをサイレンシングするアプローチを示す図であり、一方は機能獲得変異を有するアレルであり、他方はＷＴ配列を有するアレルである。サイレンシング配列は、ＲＮＡｉカセットであり得る。サイレンシング耐性ＣＤＳは、結合を阻止するためにサイレンシング標的配列内に変異を有することができる。あるいは、ＣＤＳは、配列を除去することができる。１つのアレルにおける機能獲得変異を有する細胞中のＳＯＤ１アレルをサイレンシングするための導入遺伝子の構造を示す図である。導入遺伝子は、置換ＳＯＤ１タンパク質を発現するためのコドン調整配列も含む。例示的な内因性遺伝子のサイレンシングおよび内因性遺伝子のタンパク質産物の置換のための導入遺伝子の構造の例を示す図である。タンパク質産生を置き換えながら、機能獲得アレルをサイレンシングするための一般的なアプローチを示す図である。ＲＮＡｉカセットによるサイレンシングを阻止するための変異を有する部分コード配列が、遺伝子に組み込まれる。遺伝子の５’または３’末端に組み込まれた場合、結果として、結果１：内因性遺伝子のサイレンシング、結果２：内因性遺伝子内のアレルのうちの１つの修飾、結果３：組み込み事象由来の新しいタンパク質の産生が得られる場合があり、ここでｍＲＮＡが、サイレンシング耐性であり、タンパク質産物が、元の遺伝子と同じまたは異なる配列を含む。内因性遺伝子の発現をサイレンシングし、タンパク質産生を置き換えるための導入遺伝子の図である。ＣＤＳ１およびＣＤＳ２は、内因性遺伝子の部分コード配列であり得る。ＣＤＳは、ＲＮＡｉカセットの対応する標的に変異を含むか、または配列が除外され得る。組み込みのための標的は、イントロン内にあってもよいが、イントロンの内因性スプライスドナー配列の後にある。また、組み込みのための標的は、イントロン－エキソン接合部にあり得る。内因性遺伝子の発現をサイレンシングし、タンパク質産生を置き換えるための導入遺伝子の図である。ＣＤＳ１およびＣＤＳ２は、内因性遺伝子の完全コード配列であり得る。ＣＤＳは、ＲＮＡｉカセットの対応する標的に変異を含むか、または配列が除外され得る。組み込みのための標的は、イントロン内にあってもよいが、イントロンの内因性スプライスドナー配列の後にある。また、組み込みのための標的は、イントロン－エキソン接合部にあり得る。内因性遺伝子の発現をサイレンシングし、タンパク質産生を置き換えるための導入遺伝子の図である。ＣＤＳ１およびＣＤＳ２は、内因性遺伝子の完全コード配列であり得る。ＣＤＳは、ＲＮＡｉカセットの対応する標的に変異を含むか、または配列が除外され得る。組み込みのための標的は、エキソン内にあってもよい。内因性遺伝子の発現をサイレンシングし、タンパク質産生を置き換えるための導入遺伝子の図である。ＣＤＳ１およびＣＤＳ２は、内因性遺伝子の完全コード配列であり得る。ＣＤＳは、ＲＮＡｉカセットの対応する標的に変異を含むか、または配列が除外され得る。組み込みのための標的は、５’ＵＴＲ内にあってもよい。組み込みのための標的は、５’ＵＴＲ領域内のイントロンであってもよいが、ＣＤＳに作動可能に連結されたスプライスアクセプターが必要である。内因性遺伝子の発現をサイレンシングし、タンパク質産生を置き換えるための導入遺伝子の図である。ＣＤＳ１およびＣＤＳ２は、内因性遺伝子の部分コード配列であり得る。ＣＤＳは、ＲＮＡｉカセットの対応する標的に変異を含むか、または配列が除外され得る。組み込みの標的は、開始コドンと停止コドンとの間の任意の場所であってもよいが、内因性スプライスアクセプター内ではなく、または最後の内因性スプライス（ｓｌｉｃｅ）アクセプターの下流ではない。本明細書に記載の導入遺伝子の組み込みを検出するゲルの画像である。１：１ｋｂラダー、２：１５９４ｂｐの予想サイズを有するｐＢＡ１１４１の３’ＨＲ接合部、３：１７７５ｂｐの予想サイズを有するｐＢＡ１１４１の３’ＨＲ接合部、４：１７７５ｂｐの予想サイズを有するｐＢＡ１１４１の３’ＨＲ接合部、５：２０６７ｂｐの予想サイズを有するｐＢＡ１１４１の３’ＮＨＥＪリバース、６：８１３ｂｐの予想サイズを有するｐＢＡ１１４２の３’ＮＨＥＪフォワード接合部、７：１２２５ｂｐの予想サイズを有するｐＢＡ１１４３の３’ＨＲ接合部、８：１４０７ｂｐの予想サイズを有するｐＢＡ１１４３の３’ＨＲ接合部、９：１２２５ｂｐの予想サイズを有するｐＢＡ１１４３の３’ＨＲ接合部、１０：１４０７ｂｐの予想サイズを有するｐＢＡ１１４３の３’ＨＲ接合部、１１：１ｋｂラダー、１２：プライマーｏＮＪＢ２０１＋ｏＮＪＢ１９０によるＷＴのＤＮＡ対照、１３：プライマーｏＮＪＢ２０２＋ｏＮＪＢ１９１によるＷＴのＤＮＡ対照、１４：プライマーｏＮＪＢ１９７＋ｏＮＪＢ１９１によるＷＴのＤＮＡ対照、１５：プライマーｏＮＪＢ２０２＋ｏＮＪＢ２１１によるＷＴのＤＮＡ対照、１６：１ｋｂラダー、１７：ｐＢＡ１１４１＋Ｃａｓ９トランスフェクションのゲノムＤＮＡ対照、１８：ｐＢＡ１１４２トランスフェクションのゲノムＤＮＡ対照、１９：ｐＢＡ１１４３＋Ｃａｓ９トランスフェクションのゲノムＤＮＡ対照、２０：ｐＢＡ１１４１＋Ｃａｓ１２ａトランスフェクションのゲノムＤＮＡ対照、２１：ｐＢＡ１１４２＋Ｃａｓ１２ａトランスフェクションのゲノムＤＮＡ対照、２２：ｐＢＡ１１４３＋Ｃａｓ１２ａトランスフェクションのゲノムＤＮＡ対照、２３：ＷＴ対照、２４：ＤＮＡなしの対照。内因性遺伝子のコード配列を修飾するための方法および組成物が本明細書に開示される。一部の実施形態では、方法は、導入遺伝子を内因性遺伝子に挿入することを含み、導入遺伝子は、内因性遺伝子のコード配列を置換する部分コード配列を提供する。また、置換タンパク質を発現すると共に、内因性遺伝子の発現を低減するための方法および組成物も、本明細書に開示される。一実施形態では、本文書は、導入遺伝子を内因性遺伝子に組み込み、ｍＲＮＡまたはタンパク質産物を修飾する方法を特徴とする。本方法は、導入遺伝子を投与することを含み、導入遺伝子は、第１および第２のスプライスドナー配列、第１および第２の部分コード配列、１つの双方向プロモーター、または第１および第２のプロモーター、ならびに、任意選択的に、第１および第２のターミネーターを含み、導入遺伝子は、内因性遺伝子内の部位を標的とする少なくとも１つのレアカッティングエンドヌクレアーゼと共に投与され、導入遺伝子は、内因性遺伝子内に組み込まれる。内因性遺伝子は、ヒ