JP-2026077709-A - タンパク質を搭載したＰＬＧＡナノスフィア

Abstract

【課題】タンパク質を搭載したＰＬＧＡナノスフィアの提供。 【解決手段】本開示は、タンパク質をカプセル封入したナノ粒子を含む組成物、および前記組成物を作製する方法を提供する。一態様では、組成物は、薬物送達ベクターおよび治療物質を含むことができ、組成物は、薬物送達ベクター放出緩衝液の条件下で、一定期間にわたり、１００，０００個の粒子の薬物送達ベクターあたり少なくとも１．０ｐｇの治療物質を溶出し、治療物質、薬物送達ベクターおよび薬物送達ベクター放出緩衝液が溶液を構成し、溶液が遠心分離され、一部が約１～１０℃で保管され、治療物質の溶出量が、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定される。本開示は、免疫系に影響を及ぼす疾患に罹患している患者における、免疫表現型を制御する方法をさらに記載する。 【選択図】なし

Inventors

• ブロック エー． リンジー
• ジャスティン イー． マーケル
• ライアン エー． ラチンスキ
• ジャビーン ノーア

Assignees

• ウエストバージニア ユニバーシティ
• ウエスト バージニア ユニバーシティー ボード オブ ガバナーズ オン ビハーフ オブ ウエスト バージニア ユニバーシティー

Dates

Publication Date

20260513

Application Date

20260209

Priority Date

20191205

Claims (1)

1. 明細書に記載の発明。

Description

関連出願への相互参照 本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１９年１２月５日出願の米国仮出願第６２／９４４，１９１号に基づく利益を主張する。 政府により支援された研究に関する記載 本出願は、国立衛生研究所／国立総合医科研究所によって助成された助成金番号２Ｕ５４ＧＭ１０４９４２－０２、Ｓ１０ＯＤ０１６１６５、Ｐ３０ＧＭ１０３４８８およびＰ２０ＧＭ１０３４３４の下、政府支援により行われた。連邦政府は、本発明において、ある程度の権利を有する。 分野 本明細書に開示されている様々な実施形態は、概して、タンパク質含有ナノスフィアの調製に関する。 本明細書に開示されている様々な実施形態は、免疫分析のための免疫表現型解析に関する。 背景 免疫刺激は、１）悪性細胞の増殖および／または腫瘍転移の形成を阻害することができる、ならびに２）ウイルスおよび細菌感染を排除することができる重要な機構である。免疫療法がん処置は、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）および細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）の軸を含めた、特異的免疫調節性チェックポイントのモノクローナル抗体の遮断を含むことができる。 歴史的には、腫瘍微小環境および免疫応答に焦点が置かれてきた。しかし、全身性応答は、持続的な免疫学的応答をもたらして、疾患を治癒することができる。多数のグループが、患者に免疫学的に発生していることをリアルタイムに説明する一助となるため、処置の免疫表現型解析に着目してきた。多数の疾患に対する免疫療法剤が一層主流となり、これらの応答の生きたデータベースを開発することが、この過程を著しく前に推し進めることになるので、上記の情報は、重要な役割を果たすことになろう。 前臨床検討により、インターロイキンは、多数の悪性腫瘍に対する抗腫瘍応答を誘発することができることが示されてきた。全身に投与されると最大化される抗腫瘍活性を有する免疫刺激性サイトカインであるインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）は、このような抗腫瘍応答を誘発することができる。ＩＬ－１２の高用量投与は、毒性副作用を有するおそれがあるが、低用量のＩＬ－１２は、安全と考えることができる。 ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）薬物送達ベクターが、ＦＤＡによって承認されており、ポリマーが分解する際に、幅広い物質を溶出することができる。治療目的の場合、ＰＬＧＡナノスフィア内に免疫刺激性インターロイキンタンパク質を潜在的に含むペプチドをカプセル封入すると、有毒な搭載用量を必要とすることなく、全身送達および組織沈着が可能となり得る。全身的状況で使用されるため、ナノスフィアは、血液による、安全かつ効果的な生物の大血管および微小血管の移動を実現することができる。 図１Ａおよび１Ｂは、ＰＬＧＡナノスフィア中のフルオレセインイソチオシアネート標識ウシ血清アルブミンタンパク質の分布を示す。 図１Ｃは、ナノスフィアの表面に吸着したタンパク質の初期放出と、その後のＰＬＧＡナノスフィアにより捕捉されたタンパク質の制御放出による、ＰＬＧＡナノスフィアからの二相タンパク質溶出曲線を示す。 図１Ｄは、ＰＬＧＡナノスフィアからの二相タンパク質放出の機構を示す。 図２は、滅菌生理食塩水に溶解されたＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ（登録商標）６４７を搭載したナノスフィア１ｍｇ／ｋｇを、腹腔内（左側のマウス）または静脈内（右側のマウス）のどちらかに注射することによって接種したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、６７分間の期間にわたるフルオロフォア分布を示す。 図３は、１０、２０、３０、４０または６０秒間、３つの異なるワット数で超音波処理されたＩＬ－１２に及ぼす超音波処理の効果を示す。 図４Ａおよび４Ｂは、それぞれ、１１，０００Ｘ（図３ａ）および１３，０００Ｘ（図３ｂ）において、２５ｍＭのトレハロースを含まないで凍結乾燥した、非搭載（ブランク）ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）酸（ＰＬＧＡ）ナノスフィアの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す。 図４Ｃは、２５ｍＭトレハロースと共に凍結乾燥した非搭載（ブランク）ＰＬＧＡナノスフィアの、５，０００Ｘ倍率での走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す。 図５Ａは、共焦点顕微鏡によりタンパク質の取り込みを可視化したＦＩＴＣ－コンジュゲートされているウシ血清アルブミンを搭載したＰＬＧＡナノスフィアを示す。 図５Ｂおよび５Ｃは、凍結乾燥した組換えマウスＩＬ－１２を搭載したＰＬＧＡナノスフィアの、それぞれ８，０００Ｘおよび２５，０００Ｘ倍率での走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示す。 図６Ａおよび６Ｂは、摂氏２５度における、それぞれ、水中に１：５０および１：１４の希釈ファクターで、非搭載（ブランク）ＰＬＧＡ酸ナノスフィアおよび組換えマウスのＩＬ－１２（ＩＬ－１２）を搭載したＰＬＧＡナノスフィアのサイズ分布分析を示す。 図６Ｃおよび６Ｄは、それぞれ、摂氏２５度における、水中に１：５０の希釈ファクターで、非搭載ブランクおよびＩＬ－１２を搭載したＰＬＧＡナノスフィアのゼータ電位分布を示す。 図７Ａおよび７Ｂは、総タンパク質（図７Ａ）および１００，０００個の粒子あたりのタンパク質（図７Ｂ）に関して、組換えマウスＩＬ－１２を搭載したＰＬＧＡナノスフィアから経時的に溶出したタンパク質の推定総量を示す。 図７Ｃは、３種の異なる粒子濃度（５億個の粒子／ｍＬ、７．５億個の粒子／ｍＬおよび１０億個の粒子／ｍＬ）の場合の、各溶出プロファイルの曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して計算した、組換えマウスのＩＬ－１２を搭載したナノスフィアのカプセル封入効率（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ：ＥＥ）を示す。 図８Ａ～８Ｃは、超音波処理出力および超音波処理時間の様々な条件下で超音波処理を使用して調製したＩＬ－１２を搭載したナノスフィアを示す。 図９は、超音波処理出力および超音波処理時間の様々な条件下で超音波処理を使用して調製したナノスフィアからのＩＬ－１２の溶出プロファイルを示す。 図１０は、７．５億個の粒子／ｍＬのナノスフィア濃度を使用する、撹拌速度の関数としての、高速撹拌を使用して調製したＰＬＧＡナノスフィアからのＩＬ－１２の溶出プロファイルを示す。 図１１は、転移性骨肉腫を処置するための、ＰＬＧＡナノスフィアに由来するＩＬ－１２の施用を示す。 図１２は、ＰＬＧＡナノスフィアからのＩＬ－１２溶出に及ぼすトレハロースおよびマグネシウム化合物の影響を示す。 図１３は、ＰＬＧＡナノスフィアからのＩＬ－１２溶出に及ぼすウシ胎児血清（ＦＢＳ）の影響を示す。 図１４は、ＰＬＧＡナノスフィアからのＩＬ－１２溶出量に及ぼす、界面活性剤単独およびＦＢＳと組み合わせた界面活性剤の影響を示す。 図１５Ａおよび１５Ｂは、ナノスフィアが様々な条件下で調製された、経時的なタンパク質の溶出率、および全溶出量パーセントとしての溶出量をそれぞれ示す。図１５Ａおよび１５Ｂは、ナノスフィアが様々な条件下で調製された、経時的なタンパク質の溶出率、および全溶出量パーセントとしての溶出量をそれぞれ示す。 図１６は、実験設計を図示する概略図を示す。 図１７は、末梢血液中のヘルパーＴリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球および調節性Ｔリンパ球のサブセットの組換えマウスＩＬ－１２（ｒｍＩＬ－１２）誘発性Ｔ細胞の疲弊を示す。 図１８は、末梢血液におけるｒｍＩＬ－１２誘発性多形核骨髄由来抑制因子細胞（ＰＭＮ－ＭＤＳＣ）骨髄球増加症を示す。 図１９は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の循環のＩＬ－１２誘発性低下を示す。 図２０Ａおよび２０Ｂは、切断時における、それぞれ、１２週間の７つの時間点全体で比較した健常マウス対疾患マウスの末梢血液中のＮＫｐ４６＋ ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の平均百分率、および末梢血液中のマウスのＮＫ細胞の百分率で階層化したマウスを示す。図２０Ａおよび２０Ｂは、切断時における、それぞれ、１２週間の７つの時間点全体で比較した健常マウス対疾患マウスの末梢血液中のＮＫｐ４６＋ ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の平均百分率、および末梢血液中のマウスのＮＫ細胞の百分率で階層化したマウスを示す。 詳細な説明 本明細書および特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が特に明白に示さない限り、複数の参照物を含む。例えば、用語「試料」は、それらの混合物を含めた、複数の試料を含む。 「ナノスフィア」または「ナノ粒子」は、超微粒子であることができる。このような粒子は、以下に限定されないが、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）を含めた、様々な物質から作製することができる。 ＰＬＧＡ薬物送達ベクターは、ＦＤＡ承認を受けており、ポリマーコーティングがＫｒｅｂｓ回路の中間体に分解されると、幅広い物質を溶出することができる。薬物溶解度、生体利用率および安定性はすべて、有機コーティングによって改変することができ、カプセル封入した基質の薬物動態および薬力学特性の大きなシフトが可能となる。腫瘍および感染の治療目的の場合、ＰＬＧＡナノスフィア内にＩＬ－１２をカプセル封入すると、有毒な搭載用量を必要とすることなく、全身送達および組織沈着が可能となり得る。負に荷電した表面は、グリコカリックスによって撃退され、そのサイズが一層小さいことに連動して、グリコカリックスがその中身を乱すことなく溶出することができる間質空間において沈着を増加させることが可能となる。しかし、現在まで、サブミクロンスケールのＰＬＧＡ粒子内にＩＬ－１２をカプセル封入することに成功していない。ナノスフィアは、塞栓を形成するリスクを最小限にしながら、血液による、安全かつ効果的な生物の微小血管（毛細血管は、約４～９ミクロンの直径となり得る）の移動を実現することができる。 カプセル封入したタンパク質を有するＰＬＧＡナノスフィアは、以下： 有機溶媒に、２．５％ｗ／ｖ～１７％ｗ／ｖのＰＬＧＡを溶解させることによって油相を調製する 水性溶媒に、１％ｗ／ｖ～３％ｗ／ｖのポリビニルアルコールを溶解させることによって水性相を調製する 水性媒体にタンパク質を懸濁させる 水性媒体を油相に添加して第１のエマルションを形成して、第１のエマルションを均質化する 第１のエマルションを水性相に添加して、第２のエマルションを形成して、第２のエマルションを均質化する 第２のエマルションから有機溶媒を蒸発させて、水溶液を形成する、および 水溶液からタンパク質を含有するＰＬＧＡナノスフィアを回収する ことによって生成することができる。 タンパク質 様々な実施形態では、タンパク質は、インターロイキン、リンホカイン、モノカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子およびケモカインからなる群から選択されるサイトカインであることができる。サイトカインは、インターロイキンまたは非免疫学的サイトカインであることができる。 サイトカインは、Ｎ末端シグナル配列、Ａ～Ｄと標識した４本のヘリックスを含む４ヘリックスバンドル、およびＤヘリックスの後に必要に応じたＣ末端伸長部を有することができる。サイトカインは、実質的なＣ末端伸長部を欠如することができ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロンアルファ－１、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターフェロンカッパ、インターフェロンタウ－１、インターフェロンオメガ－１、またはＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１からなる群から選択されるインターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ－１２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２６およびＩＬ－２７のアルフ