JP-2026514562-A - 眼オルガノイド

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Abstract

本発明は、結膜または角膜輪部オルガノイドのｉｎｖｉｔｒｏ生産方法に関する。また、新たな結膜または角膜輪部オルガノイドと、再生医療におけるインプラントとしての使用、およびこの組織の研究のための結膜モデルまたは角膜輪部組織および／または角膜組織モデルとしての使用も包含する。また、結膜オルガノイドまたは角膜輪部オルガノイドの生産に特に適した特定の細胞培養培地も開示する。【選択図】なし

Inventors

クレヴァース、ヨハンネスカルロス
バニエエロー、マリー
アンダーソン－ロルフ、アマンダ
チェロッティ、マルティナ

Assignees

コーニンクレッカネーデルラントアカデミーファンヴェテンシャッペン

Dates

Publication Date: 20260512
Application Date: 20240321
Priority Date: 20230321

Claims (20)

（ａ）結膜幹細胞および／または角膜輪部幹細胞を提供するステップと、（ｂ）結膜オルガノイドまたは角膜輪部オルガノイドを形成するのに適した条件下で、前記結膜幹細胞および／または前記角膜輪部幹細胞を培養培地中で培養するステップと、を備える、結膜オルガノイドまたは角膜輪部オルガノイドを製造するｉｎｖｉｔｒｏ方法。
前記結膜幹細胞または前記角膜輪部幹細胞を前記培養培地中で培養する前記ステップは、細胞拡大培養培地中で培養するステップを含み、好ましくは、前記細胞拡大培養培地は、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β）シグナル伝達経路の阻害剤、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の阻害剤、および／またはＷｎｔ経路のアゴニストを含む請求項１に記載のｉｎｖｉｔｒｏ方法。
前記培養培地中での培養が、前記結膜オルガノイドの形成を可能にするのに十分な期間であるか、または前記角膜輪部オルガノイドの形成を可能にするのに十分な期間であり、好ましくは、形成された結膜オルガノイドが、転写因子腫瘍タンパク質ｐ６３（ＴＰ６３）、ケラチン－１９（ＫＲＴ１９）、ムチンショートバリアントＳ１（ＭＵＣ１）、およびアクアポリン－５（ＡＱＰ５）のうちの１つ以上を発現するケラチノサイトを含む請求項１～２のいずれか１項に記載のｉｎｖｉｔｒｏ方法。
前記培養培地中での培養が少なくとも３日間である請求項１～３のいずれか１項に記載のｉｎｖｉｔｒｏ方法。
前記結膜オルガノイドおよび／または前記角膜輪部オルガノイドが、哺乳類、げっ歯類またはヒトの結膜、好ましくはヒトの結膜または角膜輪部のオルガノイドである請求項１～４のいずれか１項に記載のｉｎｖｉｔｒｏ方法。
前記結膜幹細胞または前記角膜輪部幹細胞がヒト結膜幹細胞またはヒト角膜輪部幹細胞であり、好ましくは、前記培養培地／前記細胞拡大培養培地が実質的に上皮成長因子（ＥＧＦ）を含まず、任意に、環状ＡＭＰ活性化因子、特にフォルスコリン、および／または１つ以上の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、特にＦＧＦ１およびＦＧＦ１０から選択される１つ以上の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、並びにそれらの組み合わせを含む請求項１～５のいずれか１項に記載のｉｎｖｉｔｒｏ方法。
前記結膜幹細胞、好ましくはヒト結膜幹細胞が、神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）を発現しているか、または神経成長因子受容体陽性結膜幹細胞である請求項１～６のいずれか１項に記載のｉｎｖｉｔｒｏ方法。
前記結膜幹細胞および／または前記角膜輪部幹細胞を前記培養培地中で培養する前記ステップは、細胞分化培養培地中で培養するステップを含み、好ましくは、前記細胞分化培養培地はトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β）シグナル伝達経路の阻害剤、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の阻害剤、および／またはＷｎｔ経路のアゴニストを含み、さらに好ましくは、前記細胞分化培養培地は、さらにＥＧＦ、線維芽細胞増殖因子、および／またはＢ２７サプリメントを実質的に含まない請求項１～７のいずれか１項に記載のｉｎｖｉｔｒｏ方法。
前記結膜幹細胞および／または前記角膜輪部幹細胞を前記培養培地中で培養するステップは、細胞拡大培養培地中で培養した後に細胞分化培養培地中で培養するステップを含む請求項１～８のいずれか１項に記載のｉｎｖｉｔｒｏ方法。
前記培養培地中、特に前記細胞分化培養培地中での培養が、前記結膜オルガノイドおよび／または前記角膜輪部オルガノイドの形成を可能にするのに十分な期間であり、好ましくは、形成された結膜オルガノイドが、ＫＲＴ－１９、ＴＰ６３、ＭＵＣ１およびＡＱＰ５のうちの１つ以上を発現するケラチノサイトを含み、さらにゴブレット細胞を含む請求項１～９のいずれか１項、好ましくは請求項８～９のいずれか１項に記載のｉｎｖｉｔｒｏ方法。
前記トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β）シグナル伝達経路の阻害剤が、Ａ８３－０１（ＣＡＳ番号：９０９９１０－４３－６）、ＳＢ－４３１５４２（ＣＡＳ番号：３０１８３６－４１－９）、ＳＢ－５０５１２４（ＣＡＳ番号：ＣＡＳ６９４４３３－５９－５）、ＳＢ－５２５３３４（ＣＡＳ番号：３５６５５９－２０－１）、ＬＹ３６４９４７（ＣＡＳ番号：３９６１２９－５３－６）、ＳＤ－２０８（ＣＡＳ番号：６２７５３６－０９－８）、ＳＪＮ２５１１（ＣＡＳ番号：２３１９９３９－０７－４）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物であり、特にＡ８３－０１（ＣＡＳ番号：９０９９１０－４３－６）である請求項１～１０のいずれか１項に記載のｉｎｖｉｔｒｏ方法。
前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）の阻害剤が、Ｎｏｇｇｉｎ（ヒトタンパク質ＵｎｉｐｒｏｔＮｒ．Ｐ９７４６６）、コーディン、フォリスタチン、グレムリン、ｔｗｉｓｔｅｄｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ（ｔｓｇ）、ｓｈｏｒｔｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ（ｓｏｇ）、ドルソモルフィン、ＬＤＮ１９３１８９（ＣＡＳ番号：１０６２３６８－２４－４）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物である請求項１～１１のいずれか１項に記載のｉｎｖｉｔｒｏ方法。
前記Ｗｎｔ経路のアゴニストが、Ｒ－スポンジン、Ｗｎｔタンパク質、Ｗｎｔサロゲート、ＲＯＣＫ阻害剤およびそれらの組み合わせからなる群より選択される請求項１～１２のいずれか１項に記載のｉｎｖｉｔｒｏ方法。
前記結膜オルガノイドおよび／または前記角膜輪部オルガノイドに含まれる細胞を解離させ、その後、解離した細胞の１つ以上を気液界面培養するステップをさらに備える請求項１～１３のいずれか１項に記載のｉｎｖｉｔｒｏ方法。
（ａ）第１のチャンバーと第２のチャンバーとを備え、前記第１のチャンバーおよび前記第２のチャンバーは多孔質膜によって分離されている容器を提供するステップと、（ｂ）前記結膜オルガノイドから解離した細胞を、前記多孔質膜の一方の面、好ましくは前記第１のチャンバーにおいて前記多孔質膜の一方の面に播種するステップと、（ｃ）培養培地を、前記多孔質膜上に播種した細胞が前記培養培地に浸るように、前記第１のチャンバーおよび／または前記第２のチャンバーに供給するステップと、（ｄ）実質的にコンフルエントな細胞層を得るのに十分な期間、前記播種した細胞を前記多孔質膜上で拡大させるステップと、（ｅ）コンフルエントになった細胞層を含むチャンバー、好ましくは前記第１のチャンバーから前記培養培地を除去し、細胞の多層を含む結膜細胞培養物を得るのに十分な期間、細胞を空気と接触させるステップと、を備え前記多孔質膜の近位の細胞層が、ＫＲＴ－１９およびＴＰ６３を発現する基底ケラチノサイトを含み、前記多孔質膜から遠位の細胞層が、ＭＵＣ１を発現する頂端ケラチノサイトと、ゴブレット細胞、特にＭＵＣ５ＡＣを発現するゴブレット細胞とを含み、好ましくは、前記培養培地が細胞拡大培養培地または細胞分化培養培地であり、より好ましくは細胞拡大培養培地である請求項１４に記載のｉｎｖｉｔｒｏ方法。
ＫＲＴ１９と、ＴＰ６３、ＭＵＣ１、およびＡＱＰ５のうちの１つ以上とを発現するケラチノサイトを含む単離された結膜オルガノイド、特にヒト結膜オルガノイド。
ゴブレット細胞、好ましくはＭＵＣ５ＡＣを発現するゴブレット細胞をさらに含む、請求項１６に記載の単離されたオルガノイド、特にヒト結膜オルガノイド。
請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法により得られる、単離された哺乳類結膜オルガノイドまたは哺乳類角膜輪部オルガノイド。
結膜細胞、好ましくは結膜オルガノイド細胞の気液界面培養物であって、Ｉ．第１のチャンバーと第２のチャンバーとを備え、前記第１のチャンバーおよび前記第２のチャンバーは多孔質膜によって分離されている容器と、ＩＩ．前記多孔質膜の少なくとも一方の面に配置された結膜細胞の多層と、を備え、前記多層は、前記多孔質膜の近位にあり、ＫＲＴ－１９およびＴＰ６３を発現する基底ケラチノサイトを含む少なくとも１つの細胞層と、支持体から遠位にあり、ＫＲＴ－１９、ＭＵＣ１およびＡＱＰ５を発現する頂端ケラチノサイトとゴブレット細胞とを含む少なくとも１つの細胞層とを含み、前記気液界面培養物は、任意に、前記第１のチャンバーおよび前記第２のチャンバーの少なくとも一方に細胞培養培地を含む、気液界面培養物。
請求項１６～１８のいずれか１項に記載の結膜オルガノイド、もしくは請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法で得られた結膜オルガノイドを含むか、または前記結膜オルガノイドからなるか、あるいは前記結膜オルガノイドから解離した細胞を含むか、または前記細胞からなる結膜インプラント。

Description

本発明は、一般にオルガノイドおよびその製造方法の分野に関する。また、治療分野および化合物スクリーニング分野におけるオルガノイドの特定の用途に関する。背景の説明には、本発明を理解するのに有用な情報が含まれる。本明細書で提供される情報のいずれかが先行技術であること、または現在請求される発明に関連すること、あるいは具体的または暗黙的に参照される刊行物が先行技術であることを認めるものではない。結膜は瞼の内面を覆っており、強膜（白目）も覆っている。結膜は、線維芽細胞、血管、免疫細胞を含む、固有質と呼ばれる実質層を含み、非角化重層上皮に覆われている。上皮には、粘液を産生するゴブレット細胞とケラチノサイトという２つの分化した細胞型が確認されている。ゴブレット細胞は涙腺とともに、眼表面を覆う涙液膜のムチン層を産生することから、結膜に関する研究のほとんどは、ゴブレット細胞に焦点を当てている。このムチン層は、涙の水層を眼表面に付着させ、蒸発性ドライアイから保護するため、涙液のホメオスタシスに不可欠である。しかしながら、上皮バリアを形成する以上の結膜ケラチノサイトの役割も、結膜幹細胞の正体も明らかにされていない。眼表面に関する研究は、主に視力に不可欠な組織である角膜に焦点を当ててきた。しかし、結膜も同様に視力に不可欠である。結膜の機能不全は最終的に角膜の恒常性に影響を及ぼし、失明につながる可能性がある。第１に、無血管角膜は免疫特権組織であり、広範な免疫反応から守られている。眼表面の免疫防御を担っているのは結膜である。第２に、物理的またはウイルス性障害によって結膜が損傷を受けると、涙液膜が不安定化し、ドライアイ、不快感、そして最終的には失明に至る。角膜輪部は、角膜と結膜（強膜、すなわち白目を覆っている）の境界であり、角膜輪部幹細胞を含んでいる。角膜は前眼部の透明な層である。この層は、光の軌跡に対して垂直に組織化され、非角化重層上皮に覆われている細胞外マトリックスを分泌するケラチノサイトで構成される。この上皮は、角膜周囲、角膜輪部と呼ばれる領域にある幹細胞によって更新される。恒常性維持時や角膜中央部の傷害後、これらの幹細胞は分裂し、分化し、組織を補充するために中心方向に移動する。もし角膜輪部に傷が生じると、角膜輪部幹細胞の欠乏につながる。このような場合、角膜輪部幹細胞、ひいては角膜の中心部は、透明でない結膜組織に置き換わり、失明に至る。このため、角膜と角膜輪部の両方が熱心に研究されてきた。角膜を研究するために、いくつかの培養モデルが存在する。これらのモデルのほとんどは、マウス胚線維芽細胞（２Ｄ構造）上で拡大された角膜輪部幹細胞か、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のオルガノイド（３Ｄ構造）である。結膜の欠損を修復するための最も標準的な手術方法は、自家結膜移植である。簡単に説明すると、これは、患者の眼球から損傷に見合った大きさの健康な結膜組織（平均１ｃｍ２）を直接採取して、損傷を覆うことを意味する。また、これは、健康な結膜を採取した強膜がむき出しになることを意味し、感染症が発生しやすくなる。その上、損傷が大きすぎるか、または健康な結膜組織を追加で必要とする場合には、この選択肢はもはや成り立たない。結膜に対する生体外細胞治療は、現在までのところ、患者が利用できるものはない。したがって、現在、臨床では対処されていない需要が明らかに存在する。単純角膜輪部上皮移植（ＳＬＥＴ）は、片眼性角膜上皮幹細胞疲弊症（ＬＳＣＤ）の治療に用いられる。これは、角膜の透明性を回復し、結膜化を防ぐために、健常眼から健康な角膜輪部幹細胞を採取し、罹患した眼に自家移植することを含む。結膜のホメオスタシスと障害、および／または角膜輪部のホメオスタシスと障害を理解するための大きな障害は、代表的なｉｎｖｉｔｒｏモデルがないことである。実際、長年にわたって確立されてきた結膜上皮のモデルには、いくつかの限界がある。それらは、十分に定義されていない条件下（すなわち、フィーダー細胞や羊膜上）で培養された短命の摘出物であるか、あるいは一般的に結膜上皮の細胞多様性および成熟度を再現していない人工多能性幹細胞由来のものである。このように、哺乳類の結膜上皮の代表的なｉｎｖｉｔｒｏモデルがないことが、結膜上皮の生物学の理解や結膜疾患の治療薬の開発を妨げてきた。同じことが、角膜輪部の恒常性と障害についても言える。結膜のｉｎｖｉｔｒｏモデルの一例が、Ｎｏｍｉら“Generation of functional conjunctival epithelium, including goblet cells, from human iPSCs”, Cell Reports 34, 108715に開示されている。Ｎｏｍｉらは、二次元の眼球様オルガノイドを形成するように拡大したヒトｉＰＳＣから結膜上皮系細胞を作製している。ＥＧＦとＫＧＦは連動して、ムチン産生ゴブレット細胞を含むｉＰＳＣ由来の結膜上皮の発生と成熟をそれぞれ促進する。Ｎｏｍｉらによって提案されたモデルは、結膜が形成される際に眼球内で起こる自然な現象を再現していない。また、このモデルでは、外胚葉自律マルチゾーン（ＳＥＡＭ）を形成する前段階が必要であり、結膜上皮を得るための手順が複雑である。ウイルス性結膜炎は、肺などに由来するがん細胞株を用いて研究されるのが一般的である。しかし、初代結膜組織を長期間、決められた条件下で増殖させるプロトコルは存在しない。ヒト羊膜（ｈＡＭ）を培養基材として用いたヒト角膜輪部（または角膜）上皮細胞のｉｎｖｉｔｒｏモデルの一例が、Mariappanら（Nat Protoc 2010 5(8):1470-9. doi: 10.1038/nprot.2010.115）に記載されている。Kauppilaらは、角膜輪部ｉｎｖｉｔｒｏモデルを提供する更なる試みについて論じている（Advanced Healthcare Material 2023 Volume12, Issue29; doi.org/10.1002/adhm.202301396）。成体幹細胞ベースのオルガノイドは、２００９年に腸組織から初めて樹立された。オルガノイドは、由来組織の本質的な構造や機能を再現した三次元構造体であり、主に腸や肝臓などの消化器官の再生医療で繰り返し提唱されてきた。しかしながら、組織の重要な特徴を再現したオルガノイドを得ることは容易ではない。また、臓器、特に大型の臓器を再生するのに十分な量のオルガノイドを作製することも難しい。それゆえ、現在ではオルガノイドの修復能力を試験する臨床試験はほとんど行われていない。このようなことから、新しい製品、組成物、方法、および用途が非常に望まれるが、まだ容易に入手できるものではない。特に、実際の結膜上皮または角膜上皮および／または角膜輪部上皮の本質的な構造的および生理学的特徴を再現する細胞培養物、例えばオルガノイドを得るために使用することができ、例えば、癌の治療において移植として使用することができる、信頼性が高く、効率的で、再現可能な製品、組成物、方法および使用に対する明らかな需要が当技術分野において存在する。したがって、本発明の基礎となる技術的課題は、前述のニーズのいずれかを満たすための、または少なくとも公衆に有用な選択肢を提供するための、そのような製品、組成物、方法および用途の提供に見出すことができる。この技術的課題は、特許請求の範囲および以下の本明細書において特徴付けられる実施形態によって解決される。本明細書において具体化され、かつ広範に記載されるように、本発明は、実際の結膜上皮または角膜上皮および／または角膜輪部上皮の本質的な構造的および生理学的特徴を再現する結膜上皮、角膜上皮および／または角膜輪部上皮のオルガノイドが、例えば、結膜生検（そのような結膜幹細胞からなる）から単離された結膜幹細胞（角膜上皮の場合）を直接的に拡大および分化させる手段によって、または、例えば、角膜輪部生検または角膜生検（そのような角膜輪部幹細胞を含む）から単離された角膜輪部幹細胞（角膜上皮および／または角膜輪部上皮、好ましくは角膜上皮または角膜輪部上皮の場合）を直接的に拡大および分化させることによって得ることができるという驚くべき発見に向けられている。好ましくは、結膜幹細胞および／または角膜輪部幹細胞は、一次組織、例えば（ヒト）結膜生検試料から、または（ヒト）角膜輪部生検試料もしくは（ヒト）角膜生検試料から得られる。結膜オルガノイド（結膜幹細胞を用いる）、および角膜輪部オルガノイド（角膜輪部幹細胞を用いる）（本明細書では角膜輪部オルガノイドとも称する）の作製のための、信頼性が高く簡便なｉｎｖｉｔｒｏ方法が提供され、これらのオルガノイドはｉＰＳＣからの逸脱を回避し、それに付随する欠点を回避する。結膜のオルガノイド（または結膜オルガノイド）は、実際の結膜上皮の本質的な構造的・生理的特徴を再現することができる。角膜輪部オルガノイドは、実際の角膜上皮および／または角膜輪部上皮の本質的な構造的および生理学的特徴を再現することができる。本明細書で開示する新しい方法は、合理的かつ実用的な期間で十分な量の結膜オルガノイドまたは角膜輪部オルガノイドを得ることを可能にし、したがって、開示される他の用途の中でも特に再生医療に有用である。本方法では、結膜幹細胞または角膜輪部幹細胞の適切な拡大および／または分化を可能にする簡便な細胞培養培地を用いる。驚くべきことに、結膜幹細胞および角膜輪部幹細胞について、本明細書に開示されるような同じ培養方法を有利に採用することができ、例えば、長期培養（例えば、１０継代以上、２０継代以上、３０継代以上）を可能にすることが見出された、オルガノイドの長期培養（例えば１０継代以上、２０継代以上、３０継代以上）を可能にし、例えばＡＬＩ培養において、結膜組織、特に結膜上皮、あるいは角膜輪部組織および／または角膜組織、特に角膜輪部上皮および／または角膜上皮に酷似した組織構造体を提供する。さらに、オルガノイドは適切な寿命を有し、これにより、結膜組織モデル、あるいは角膜輪部組織および／または角膜組織（特に角膜輪部上皮および／または角膜上皮）として有用である。これらのモデルにより、結膜上皮あるいは角膜輪部上皮および／または角膜上皮を調節し得る化合物の試験が可能となる。このモデルは、結膜、または角膜輪部および／もしくは角膜（特に角膜輪部上皮および／もしくは角膜上皮）の病的状態を確実に再現することができ、結膜疾患の予防および／もしくは治療、または角膜輪部および／もしくは角膜の疾患の予防および／もしくは治療のための薬剤候補のスクリーニング用モデルとしても有用である。最後に、本発明のｉｎｖｉｔｒｏ方法を容易かつ確実に実施するための、使用準備済みの細胞培養ツール、試薬、および装置も提供する。したがって、第１の態様において、本発明は、結膜オルガノイドまたは角膜輪部オルガノイドを製造するｉｎｖｉｔｒｏ方法に関し、該方法は、（ａ）結膜幹細胞または角膜輪部幹細胞を提供するステップと、（ｂ）結膜オルガノイドまたは角膜輪部オルガノイドを形成するのに適した条件下で、結膜幹細胞または角膜輪部幹細胞を培養培地中で培養するステップと、を備える。当業者に理解される通り、本発明の別の態様によれば、結膜幹細胞および角膜輪部幹細胞は、好ましくはそのような幹細胞を含む組織の生検試料から得られるが、オルガノイドを製造するための同じｉｎｖｉｔｒｏ方法において一緒に提供することができる。したがって、ＡＬＩ培養を含む培養方法、使用する培地、こうして得られたオルガノイドまたはＡＬＩ培養物の使用、およびこうして得られたオルガノイドに関連する本明細書に開示された情報が、同様に、すべての実施形態では