JP-2026514587-A - 真核細胞にＤＮＡ配列を正確に挿入するための組換え酵素

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Abstract

ＤＮＡ断片及び導入遺伝子をゲノムに部位特異的に挿入するための構築物は、組換え酵素を含む。この酵素は、第１及び第２の外部単量体がそれぞれ第１及び第２の内部単量体に結合したヘテロ二量体構造のヘテロ二量体に有利な複数の変異を有する修飾されたＨＩＶ－１インテグラーゼ（ＨＩＶＩＮ）四量体を含む。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、ポリペプチドリンカーを介して外部単量体のＮ末端領域に結合される。２つのＴＡＬＥは、酵素に配列特異性を付与し、標的ＤＮＡ構造との非特異的相互作用を防止する。修飾されたＨＩＶＩＮ単量体は、ＴＡＬＥが最外部の単量体に結合し、ＴＡＬＥがＨＩＶＩＮの触媒領域に対して配置されることを確実にする。ポリヌクレオチドは、ＨＩＶＩＮの内部単量体に結合している。ＴＡＬＥは、単独で、またはレンチウイルスカプシド内で核に輸送されると、ＤＮＡと相互作用してＨＩＶＩＮを局在化させ、その後、ＨＩＶＩＮは、ポリヌクレオチドを組み込む。【選択図】図１

Inventors

ローラー，グレゴリー，ダブリュ．
コファス，マテオス

Assignees

レンセラーポリテクニックインスティテュート
ローラー，グレゴリー，ダブリュ．
コファス，マテオス

Dates

Publication Date: 20260512
Application Date: 20240429
Priority Date: 20230427

Claims (20)

組換え酵素遺伝子編集システムであって、組換え酵素であって、前記酵素が、ＨＩＶインテグラーゼ（ＨＩＶＩＮ）四量体構造と、前記ＨＩＶＩＮ四量体に結合した２つ以上の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）と、を含む、組換え酵素と、前記ＨＩＶＩＮに結合して遺伝子編集構築物を形成する１つ以上のポリヌクレオチドと、を含む、組換え酵素遺伝子編集システム。
前記ＨＩＶＩＮが、第１の内部単量体及び第２の内部単量体、ならびに第１の外部単量体及び第２の外部単量体を含む４つの単量体サブユニットを含み、前記単量体サブユニットのうちの少なくとも２つが、そのＮ末端ドメインに結合したＴＡＬＥを有する、請求項１に記載のシステム。
第１のＴＡＬＥが、第１のポリペプチドリンカーによって前記ＨＩＶＩＮの前記第１の外部単量体に結合され、第２のＴＡＬＥが、第２のポリペプチドリンカーによって前記ＨＩＶＩＮの前記第２の外部単量体に結合される、請求項２に記載のシステム。
前記第１のポリペプチドリンカー及び前記第２のポリペプチドリンカーが、可撓性、剛性、またはそれらの組み合わせである、請求項３に記載のシステム。
前記第１のＴＡＬＥ及び前記第２のＴＡＬＥの長さが異なる、請求項３に記載のシステム。
前記第１のＴＡＬＥが、第１の領域で標的ＤＮＡ構造に結合するように構成され、前記第２のＴＡＬＥが、第２の領域で前記標的ＤＮＡ構造に結合するように構成され、前記第１の領域及び前記第２の領域が、前記標的ＤＮＡ構造上で約１５塩基対～約２５塩基対だけ離隔している、請求項３に記載のシステム。
前記ＨＩＶＩＮが、野生型ＨＩＶＩＮであって、ＬＥＤＧＦ／ｐ７５とのＨＩＶＩＮの会合を低減する変異、前記第１の外部単量体及び前記第２の外部単量体のそれぞれに対するＥ１５２Ｑ変異、前記第１の外部単量体及び前記第２の外部単量体のそれぞれに対するＫ１８６Ｑ変異、またはそれらの組み合わせを有する、野生型ＨＩＶＩＮを含む、請求項３に記載のシステム。
前記遺伝子編集構築物が、レンチウイルスカプシド中に、レンチウイルスベクターの一部として、またはそれらの組み合わせで提供される、請求項１に記載のシステム。
標的生物におけるゲノム物質を編集する方法であって、組換え酵素を提供することであって、前記酵素が、ＨＩＶインテグラーゼ（ＨＩＶＩＮ）四量体構造と、前記ＨＩＶＩＮ四量体に結合した２つ以上の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）と、を含む組換え酵素を提供するステップと、１つ以上のポリヌクレオチドを前記組換え酵素に結合させて遺伝子編集構築物を形成するステップと、有効量の前記遺伝子編集構築物を前記標的生物に投与するステップと、ある濃度の前記遺伝子編集構築物を前記標的生物の細胞核に輸送するステップと、前記ＴＡＬＥを介して前記遺伝子編集構築物を標的ＤＮＡ構造上に局在化させるステップと、前記１つ以上のポリヌクレオチドを、前記標的ＤＮＡ構造において前記標的生物の前記ゲノム物質に挿入するステップと、を含む、方法。
前記ＨＩＶＩＮが、第１の内部単量体及び第２の内部単量体、ならびに第１の外部単量体及び第２の外部単量体を含む４つの単量体サブユニットを含み、前記単量体サブユニットのうちの少なくとも２つが、そのＮ末端ドメインに結合したＴＡＬＥを有し、第１のＴＡＬＥが、第１のポリペプチドリンカーによって前記ＨＩＶＩＮの前記第１の外部単量体に結合され、第２のＴＡＬＥが、第２のポリペプチドリンカーによって前記ＨＩＶＩＮの前記第２の外部単量体に結合される、請求項９に記載の方法。
前記第１のポリペプチドリンカー及び前記第２のポリペプチドリンカーが、可撓性、剛性、またはそれらの組み合わせである、請求項１０に記載の方法。
前記第１のＴＡＬＥが前記第２のＴＡＬＥよりも長い、請求項１０に記載の方法。
前記第１のＴＡＬＥが、第１の領域で前記標的ＤＮＡ構造に結合するように構成され、前記第２のＴＡＬＥが、第２の領域で前記標的ＤＮＡ構造に結合するように構成され、前記第１の領域及び前記第２の領域が、前記標的ＤＮＡ構造上で約１５塩基対～約２５塩基対だけ離隔している、請求項１０に記載の方法。
前記ＨＩＶＩＮが、野生型ＨＩＶＩＮであって、ＬＥＤＧＦ／ｐ７５とのＨＩＶＩＮの会合を低減する変異、前記第１の外部単量体及び前記第２の外部単量体のそれぞれに対するＥ１５２Ｑ変異、前記第１の外部単量体及び前記第２の外部単量体のそれぞれに対するＫ１８６Ｑ変異、またはそれらの組み合わせを有する、野生型ＨＩＶＩＮを含む、請求項１０に記載の方法。
前記遺伝子編集構築物が、レンチウイルスカプシド中に、レンチウイルスベクターの一部として、またはそれらの組み合わせで提供される、請求項９に記載の方法。
組換え酵素遺伝子編集システムであって、組換え酵素であって、前記酵素が、第１の内部単量体及び第２の内部単量体、ならびに第１の外部単量体及び第２の外部単量体を含むＨＩＶインテグラーゼ（ＨＩＶＩＮ）四量体であって、前記第１の内部単量体及び前記第２の内部単量体が互いに結合しており、前記第１の外部単量体が前記第１の内部単量体に結合しており、前記第２の外部単量体が前記第２の内部単量体に結合している、ＨＩＶＩＮ四量体と、第１のポリペプチドリンカーを介して前記第１の外部単量体のＮ末端領域に結合した第１の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、及び第２のポリペプチドリンカーを介して前記第２の外部単量体のＮ末端領域に結合した第２のＴＡＬＥと、を含む、組換え酵素と、前記第１の内部単量体及び前記第２の内部単量体のうちの少なくとも１つに結合して遺伝子編集構築物を形成する１つ以上のポリヌクレオチドと、前記遺伝子編集構築物を封入したレンチウイルスカプシドと、を含む、組換え酵素遺伝子編集システム。
前記第１のポリペプチドリンカー及び前記第２のポリペプチドリンカーが、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号５）を含む、請求項１６に記載のシステム。
前記第１のＴＡＬＥが前記第２のＴＡＬＥよりも長い、請求項１６に記載のシステム。
前記第１のＴＡＬＥが、約３０塩基対のＤＮＡ構造セグメントを標的とする、請求項１８に記載のシステム。
前記ＨＩＶＩＮ四量体が、野生型ＨＩＶＩＮであって、前記第１の内部単量体については、Ｙ９９Ｄ、Ｋ１０３Ｅ、Ｋ１７３Ｅ、及びＫ１８６Ｅ変異、前記第２の内部単量体については、Ｅ９６Ｋ、Ｙ９９Ｅ、Ｋ１０３Ｅ、Ｖ２０１Ｈ、Ｄ２５Ｋ、及びＥ１１Ｋ変異、前記第１の外部単量体については、Ｅ８７Ｋ、Ｅ９６Ｋ、Ｅ１５２Ｑ、Ｋ１８６Ｑ、及びＫ２１５Ｅ変異、前記第２の外部単量体については、Ｅ１５２Ｑ、Ｋ１７３Ｅ、Ｔ１７４Ｋ、Ｋ１８６Ｑ、及びＩ２０４Ｄ変異、ならびに、ＬＥＤＧＦ／ｐ７５とのＨＩＶＩＮの会合を低減する変異を有する、野生型ＨＩＶＩＮを含む、請求項１６に記載のシステム。

Description

関連出願の相互参照本出願は、２０２４年４月２６日に出願された米国仮特許出願第６３／６３９，００７号及び２０２３年４月２７日に出願された同第６３／４６２，３７７号の利益を主張するものであり、これらの出願は、その全体が本明細書に開示されているかのように参照により組み込まれる。ゲノミクスの分野では、導入遺伝子及び外因性ＤＮＡ断片を生物のゲノムに挿入して特定の目的を達成するために自然に進化した様々なメカニズムが存在する。これらの酵素のメカニズムの多くは解明されており、それらの目的は、遺伝物質をゲノム内の新しい場所に転移させることである。残念なことに、これらの酵素の多くは、トランスポゾンまたはウイルスに由来し、細胞の寿命もそのゲノムの安定性もサポートしない。このため、自然界の多くのメカニズムは、オフターゲット変異を実質的に伴わずにＤＮＡを特定の遺伝子座に確実に挿入するのに十分に正確ではない。様々なリコンビナーゼなどの他のメカニズムが存在するが、ＤＮＡを挿入するそれらの能力にも制限がある。なぜなら、挿入を行うにはターゲット配列がゲノム内にすでに存在している必要があり、これは通常、最初の挿入が行われる必要があるためである。ある特定のタンパク質を改変してＤＮＡ挿入に対する配列特異性を高める試みがなされてきたが、ほとんどの場合、これらは、多くの臨床応用に有用となるのに必要な精度を示しておらず、またはｉｎｖｉｖｏで細胞を効果的にトランスフェクトすることができない。近年、プライムエディター、ツインプライムエディター、及び塩基エディターなど、１００ヌクレオチド未満の規模でＤＮＡの小さな領域を挿入、編集、または除去するための方法が開発されている。しかしながら、これらの方法のほとんどすべては、何らかの形で同じＣａｓバックボーンに依存しており、精度に関して同様の問題を抱えがちである。Ｓｎｉｐｅｒ－Ｃａｓ９のような「高度に正確な」バリエーションでさえ、場合によってはオフターゲット変異率が依然として１０％にも達し、他のバリエーションでは、精度の向上と修飾の効率の維持の間で明確なトレードオフが見られる。ゲノム物質を正確に編集することが難しく、特にｉｎｖｉｖｏではオフターゲット改変のリスクが高いため、現在の遺伝子治療（特にＣＲＩＳＰＲまたはその誘導体の形態を含むもの）は、最も重篤な症例に限定されており、細胞を修飾し得る前に細胞を抽出する必要があり、これらの治療の全体的な有用性は最小限に抑えられる。したがって、部位特異的なｉｎｖｉｖｏゲノム編集を可能にし、それによって遺伝子異常を有する患者のための信頼性の高い遺伝子治療を可能にする遺伝子編集システム及び方法が求められている。本開示の態様は、組換え酵素遺伝子編集システムを対象とする。いくつかの実施形態では、組換え酵素遺伝子編集システムは、ＨＩＶインテグラーゼ（ＨＩＶＩＮ）と、ＨＩＶＩＮに結合した２つ以上の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）とを含む組換え酵素を含む。いくつかの実施形態では、組換え酵素は、ＨＩＶＩＮに結合して遺伝子編集構築物を形成する１つ以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子編集構築物は、レンチウイルスカプシド中に、レンチウイルスベクターの一部として、またはそれらの組み合わせで提供される。いくつかの実施形態では、ＨＩＶＩＮは、第１の内部単量体及び第２の内部単量体、ならびに第１の外部単量体及び第２の外部単量体を含む４つの単量体サブユニットを含む。いくつかの実施形態では、単量体サブユニットのうちの少なくとも２つは、そのＮ末端ドメインに結合したＴＡＬＥを有する。いくつかの実施形態では、第１のＴＡＬＥは、第１のポリペプチドリンカーによってＨＩＶＩＮの第１の外部単量体に結合され、第２のＴＡＬＥは、第２のポリペプチドリンカーによってＨＩＶＩＮの第２の外部単量体に結合される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、剛性である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、可撓性である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、グリシン残基から構成される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ＧＧＧＳドメイン、ＥＡＡＡＫドメイン、またはそれらの組み合わせの反復を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ＧＧＧＳドメイン、ＥＡＡＡＫドメイン、またはそれらの組み合わせの交互反復を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号５）を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドリンカー及び第２のポリペプチドリンカーは、グリシン残基から構成される。いくつかの実施形態では、第１のＴＡＬＥ及び第２のＴＡＬＥの長さが異なる。いくつかの実施形態では、第１のＴＡＬＥは、第２のＴＡＬＥよりも長い。いくつかの実施形態では、第１のＴＡＬＥは、第１の領域で標的ＤＮＡ構造に結合するように構成され、第２のＴＡＬＥは、第２の領域で標的ＤＮＡ構造に結合するように構成され、第１の領域及び第２の領域は、標的ＤＮＡ構造上で約１５塩基対～約２５塩基対だけ離隔している。いくつかの実施形態では、ＨＩＶＩＮは、ＬＥＤＧＦ／ｐ７５とのＨＩＶＩＮの会合を低減する変異、第１の外部単量体及び第２の外部単量体のそれぞれに対するＥ１５２Ｑ変異、第１の外部単量体及び第２の外部単量体のそれぞれに対するＫ１８６Ｑ変異、またはそれらの組み合わせを有する野生型ＨＩＶＩＮを含む。本開示の態様は、標的生物、例えば患者におけるゲノム物質を編集する方法を対象とする。いくつかの実施形態では、この方法は、組換え酵素を提供することと、１つ以上のポリヌクレオチドを組換え酵素に結合させて遺伝子編集構築物を形成することと、有効量の遺伝子編集構築物を患者に投与することと、ある濃度の遺伝子編集構築物を患者の細胞核に輸送することと、ＴＡＬＥを介して遺伝子編集構築物を標的ＤＮＡ構造上に局在化させることと、１つ以上のポリヌクレオチドを、標的ＤＮＡ構造において患者のゲノム物質に挿入することとを含む。いくつかの実施形態では、組換え酵素は、ＨＩＶＩＮ四量体と、ＨＩＶＩＮ四量体に結合した２つ以上のＴＡＬＥとを含む。いくつかの実施形態では、ＨＩＶＩＮは、第１の内部単量体及び第２の内部単量体、ならびに第１の外部単量体及び第２の外部単量体を含む４つの単量体サブユニットを含むように設計される。いくつかの実施形態では、内部単量体及び／または外部単量体は、所望のパターンで優先的に結合して、所望の四量体構造を正しく組み立てる可能性を増加させるための変異を含む。いくつかの実施形態では、単量体サブユニットのうちの少なくとも２つは、そのＮ末端ドメインに結合したＴＡＬＥを有する。いくつかの実施形態では、第１のＴＡＬＥは、第１のポリペプチドリンカーによってＨＩＶＩＮの第１の外部単量体に結合され、第２のＴＡＬＥは、第２のポリペプチドリンカーによってＨＩＶＩＮの第２の外部単量体に結合される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、剛性である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、可撓性である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、グリシン残基から構成される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ＧＧＧＳドメイン、ＥＡＡＡＫドメイン、またはそれらの組み合わせの反復を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ＧＧＧＳドメイン、ＥＡＡＡＫドメイン、またはそれらの組み合わせの交互反復を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号５）を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドリンカー及び第２のポリペプチドリンカーは、グリシン残基から構成される。いくつかの実施形態では、第１のＴＡＬＥ及び第２のＴＡＬＥの長さが異なる。いくつかの実施形態では、第１のＴＡＬＥは、第２のＴＡＬＥよりも長い。いくつかの実施形態では、第１のＴＡＬＥは、第１の領域で標的ＤＮＡ構造に結合するように構成され、第２のＴＡＬＥは、第２の領域で標的ＤＮＡ構造に結合するように構成され、第１の領域及び第２の領域は、標的ＤＮＡ構造上で約１５塩基対～約２５塩基対だけ離隔している。いくつかの実施形態では、遺伝子編集構築物は、レンチウイルスカプシド中に、レンチウイルスベクターの一部として、またはそれらの組み合わせで提供される。いくつかの実施形態では、ＨＩＶＩＮは、ＬＥＤＧＦ／ｐ７５とのＨＩＶＩＮの会合を低減する変異、第１の外部単量体及び第２の外部単量体のそれぞれに対するＥ１５２Ｑ変異、第１の外部単量体及び第２の外部単量体のそれぞれに対するＫ１８６Ｑ変異、またはそれらの組み合わせを有する野生型ＨＩＶＩＮを含む。本開示の態様は、組換え酵素を含む組換え酵素遺伝子編集システムを対象とする。いくつかの実施形態では、組換え酵素は、第１の内部単量体及び第２の内部単量体、ならびに第１の外部単量体及び第２の外部単量体を含むＨＩＶインテグラーゼ（ＨＩＶＩＮ）四量体であって、第１の内部単量体及び第２の内部単量体が互いに結合しており、第１の外部単量体が第１の内部単量体に結合しており、第２の外部単量体が第２の内部単量体に結合している、ＨＩＶＩＮ四量体と、第１のポリペプチドリンカーを介して第１の外部単量体のＮ末端領域に結合した第１のＴＡＬＥ、及び第２のポリペプチドリンカーを介して第２の外部単量体のＮ末端領域に結合した第２のＴＡＬＥと、を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは、第１の内部単量体及び第２の内部単量体のうちの少なくとも１つに結合して遺伝子編集構築物を形成する。いくつかの実施形態では、レンチウイルスカプシドは、遺伝子編集構築物を封入する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、剛性である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、可撓性である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、グリシン残基から構成される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ＧＧＧＳドメイン、ＥＡＡＡＫドメイン、またはそれらの組み合わせの反復を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ＧＧＧＳドメイン、ＥＡＡＡＫドメイン、またはそれらの組み合わせの交互反復を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号５）を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドリンカー及び第２のポリペプチドリンカーは、グリシン残基から構成される。いくつかの実施形態では、第１のＴＡＬＥ及び第２のＴＡＬＥの長さが異なる。いくつかの実施形態では、第１のＴＡＬＥは、第２のＴＡＬＥよりも長い。いくつかの実施形態では、各ＴＡＬＥは、約８塩基対～約３１塩基対のＤＮＡ構造セグメントを標的とする。いくつかの実施形態では、第１のＴＡＬＥは、約３０塩基対のＤＮＡ構造セグメントを標的とする。いくつかの実施形態では、ＨＩＶＩＮ四量体は、第１の内部単量体については、Ｙ９９Ｄ、Ｋ１０３Ｅ、Ｋ１７３Ｅ、及びＫ１８６Ｅ変異、第２の内部単量体については、Ｅ９６Ｋ、Ｙ９９Ｅ、Ｋ１０３Ｅ、Ｖ２０１Ｈ、Ｄ２５Ｋ、及びＥ１１Ｋ変異、第１の外部単量体については、Ｅ８７Ｋ、Ｅ９６Ｋ、Ｅ１５２Ｑ、Ｋ１８６Ｑ、及びＫ２１５Ｅ変異、第２の外部単量体については、Ｅ１５２Ｑ、Ｋ１７３Ｅ、Ｔ１７４Ｋ、Ｋ１８６Ｑ、及びＩ２０４Ｄ変異、ならびに、ＬＥＤＧＦ／ｐ７５とのＨＩＶＩＮの会合を低減する変異を有する野生型ＨＩＶＩＮを含む。いくつかの実施形態では、ＨＩＶＩＮ四量体は、第１の内部単量体については、Ｙ９９Ｄ、Ｋ１０３Ｅ、Ｋ１７３Ｅ、及び