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JP-2026514620-A - ポリデオキシリボヌクレオチドを含むエクソソーム、これを含む組成物、並びにその製造方法

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Abstract

ポリデオキシリボヌクレオチド（ＰＤＲＮ）を含むエクソソーム、これを含む組成物、並びにその製造方法に関し、そのＰＤＲＮ含有エクソソームは、魚類の精巣組織に由来し、低分子の高純度ＰＤＲＮを含有している。また、超音波処理という簡単な過程を通じて低分子ＰＤＲＮを多量含有するエクソソームを誘導することができ、さらに、分離されたエクソソームに超音波を処理して低分子化したＰＤＲＮエクソソームを製造することができ、細胞内吸収率が高く、組織再生または抗炎症組成物の製造に有用に活用できる。 【選択図】図５

Inventors

  • キム、スン ハグ

Assignees

  • ステムオン インコーポレーテッド

Dates

Publication Date
20260513
Application Date
20231023
Priority Date
20221114

Claims (14)

  1. 魚類の精巣組織から分離したエクソソームであって、 前記エクソソームは、内部に魚類の精巣組織由来のポリデオキシリボヌクレオチド（ＰＤＲＮ）を含むものである ことを特徴とするエクソソーム。
  2. 前記ＰＤＲＮは１ｋｂまでの長さに低分子化されたものである 請求項１に記載のエクソソーム。
  3. 前記ＰＤＲＮは１００ｂｐ～５００ｂｐの長さに低分子化されたものである 請求項１に記載のエクソソーム。
  4. 前記魚類は、サケまたはタラである 請求項１に記載のエクソソーム。
  5. 前記魚類は、サケであり、前記エクソソームはＰＤＲＮを５００ｐｇ～１０００ｐｇ含むものである 請求項１に記載のエクソソーム。
  6. 魚類の精巣組織を粉砕するステップと、 組織のホモジネートに超音波を処理するステップと、 前記超音波処理された組織のホモジネートからＰＤＲＮを含むエクソソームを分離するステップと、を含む ことを特徴とするＰＤＲＮ含有エクソソームの製造方法。
  7. 前記超音波処理は、周波数が１０ＫＨｚ～３０ＫＨｚであり、強度は最大値に対して約１５～４０％の出力強度で、５秒～３５秒間行われる 請求項６に記載のＰＤＲＮ含有エクソソームの製造方法。
  8. 前記ＰＤＲＮは１ｋｂ以下の長さに低分子化されたものである 請求項６に記載のＰＤＲＮ含有エクソソームの製造方法。
  9. 前記ＰＤＲＮを含むエクソソームを分離するステップは、 前記超音波処理された組織のホモジネートを遠心分離して上清を得るステップと、 前記上清をフィルターでろ過してろ液を得るステップと、 前記ろ液を遠心分離して濃縮するステップと、を含む 請求項６に記載のＰＤＲＮ含有エクソソームの製造方法。
  10. 前記分離されたＰＤＲＮを含むエクソソームに超音波を処理するステップをさらに含む 請求項６に記載のＰＤＲＮ含有エクソソームの製造方法。
  11. 前記エクソソームに処理する超音波は、周波数が１０ＫＨｚ～３０ＫＨｚであり、強度は最大値に対して約１５～４０％の出力強度で、７０秒～１２０秒間行われるものである 請求項１０に記載のＰＤＲＮ含有エクソソームの製造方法。
  12. 前記エクソソームに超音波を処理するステップ後、ＰＤＲＮは１００ｂｐ～５００ｂｐの長さに低分子化されるものである 請求項１０に記載のＰＤＲＮ含有エクソソームの製造方法。
  13. 請求項１に記載のエクソソームを含む ことを特徴とする組織再生用組成物。
  14. 請求項１に記載のエクソソームを含む ことを特徴とする抗炎症用化粧料組成物。

Description

本発明は、ポリデオキシリボヌクレオチド（ＰＤＲＮ）を含むエクソソーム、これを含む組成物、並びにその製造方法に関する。より具体的には、魚類の精巣組織由来のＰＤＲＮエクソソーム、これを含む組織再生用組成物、抗炎症用化粧料組成物、並びにその製造方法に関する。 ポリデオキシリボヌクレオチド（Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＰＤＲＮ）は、リン酸、および４種の塩基であるアデニン、グアニン、チミン、シトシンを含むものであって、４種の塩基とデオキシリボースとリン酸とが結合された構造が繰り返し単位を構成して高分子量の二本鎖ポリマーを形成したものであり、さらに、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）の４種の塩基と糖とリン酸とが繰り返し単位となって一本鎖ポリマーを形成した遺伝物質である。 これらのＤＮＡ又はＲＮＡのような遺伝物質は、加水分解されることができ、全ての生命体にタンパク質と結合するか、又は遊離状態で分布している。遊離状態の一本鎖ＲＮＡは、相補性を有する部分が互いに水素結合を形成することによってヘアピン構造をなしながら部分的に二本鎖を形成することもある。 動物の精子または卵子または植物の生長点部位は、他の組織に比べて、ＰＤＲＮ含量が他の部位に比べて相対的に高く、このような遺伝物質は、低分子、高分子、抽出方法によって効率及び効果が異なっており、最終産物であるＰＤＲＮは、安全性が確保された低分子化され、アデノシンＡ２レセプターと複合体を形成し、ＶＥＧＦ分泌を促進して血管形成を誘導し、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞を活性化させるという事実が知られている。 ＰＤＲＮ（Ｐｏｌｙｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）は、高分子物質の特性である粘弾性を有するとともに、皮内注射時に組織修復効果を奏する。すなわち、皮膚組織を構成している線維芽細胞を増殖し、活性を高めてコラーゲンのような細胞外マトリックスの分泌を促進することによって、単なる皮膚充填剤ではない皮膚組織の再生を誘導することができる新しい概念の組織修復医療機器の主成分となり、人間の身体組織の再生および炎症緩和に格別の効果を奏している。 ＰＤＲＮは、皮膚再生のシグナル伝達体であるＡ２プリン受容体を刺激して各種成長因子分泌促進、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）による毛細血管の生成、血液循環改善、抗炎症作用および毛細血管漏出防止機能をし、特別な副作用なく、皮膚の再生を促進して火傷や慢性創傷などに効果的であることが知られている。ヨーロッパでは、既に医薬品許可を受けて多様に活用されており、韓国内でも専門医薬品として、創傷治癒、組織再生等の用途で用いられている。 一方、エクソソームは、自然的に分泌される直径３０～２００ｎｍのナノベシクルであって、由来細胞から遺伝物質を担持する重要なナノ媒介体として作用することができることが知られている。しかし、エクソソームは、現在大量生産し難いのが実情である。例えば、１リットルの培地で培養した６千万個の間葉系幹細胞から得られるエクソソームは、含有されているタンパク質含量を基準に１～－２ｍｇが得られるレベルである。これは、マウス数匹の治療実験に使用することができる量で、ヒトの場合、例えば、対宿主性移植片病（Ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔｄｉｓｅａｓｅ、ＧＶＨＤ）の治療のために使用されるエクソソームは、タンパク質含量を基準に、１回患者の体重１ｋｇあたり０．０５～０．６ｍｇが必要であることが知られている。したがって、エクソソームを臨床的、商業的に使用するためには、歩留まりを高めることができる技術が求められている。 そこで、本発明は、魚類の精巣組織に超音波刺激を提供して、ＰＤＲＮを含むエクソソームを多量生産することができる技術であって、ＰＤＲＮ及びエクソソームの利点をいずれも活用できることと予想される。 サケ精巣ＰＤＲＮエクソソームの免疫蛍光画像を分析した結果である。サケ精巣から抽出したＰＤＲＮエクソソームに対してＰＥ標識抗ＣＤ６３抗体（緑色、Ｈ５Ｃ６、ＰＥ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＴＭ）を用いた免疫蛍光染色およびＤＩＤ染色（赤色、ＶｙｂｒａｎｔＴＭＤＩＤ Ｃｅｌｌ－Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ；Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ社製）を一晩進めた。染色されたＰＤＲＮエクソソームは、免疫蛍光画像共焦点顕微鏡（ＤＭｉ８、ＬＥＩＣＡ社製）で分析し、マージされた画像は、最上側の黄色と分析された。サケ精巣ＰＤＲＮエクソソームのフローサイトメトリー分析結果である。超音波処理済みの（Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）サケ精巣ＰＤＲＮエクソソームにアルデヒド／硫酸塩ラテックスビーズ（Ａｌｄｅｈｙｄｅ／ｓｕｌｆａｔｅ－ｌａｔｅｘ ｂｅａｄｓ）（Ａ３７３０４、Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ社製）を付着した後、ＰＥ標識されたＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）抗体とＡＰＣ標識ＣＤ８１（１Ｄ６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）抗体を用いてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＭｅｌｏｄｙＴＭ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で分析した。サケ低分子ＰＤＲＮエクソソームの粒度分布及び数の分析結果である。サケ精巣ＰＤＲＮエクソソームを超音波条件別に２つのグループに分けてナノサイト（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ）でＰＤＲＮエクソソームの粒度および粒度分布を確認した。＃１：超音波未処理エクソソーム（Ｎｏ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）、＃２：超音波処理済みのエクソソーム（Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）。サケ精巣から超音波条件に応じて分離されたＰＤＲＮエクソソーム数の比較分析結果である。サケ精巣からＰＤＲＮエクソソームを超音波条件別に分離してそれぞれのエクソソームの数を比較した。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１。超音波によるサケ精巣低分子ＰＤＲＮエクソソーム内に含まれたＤＮＡ電気泳動及び含量の分析結果である。図５Ａは、サケ精巣（組織溶解物）から抽出したゲノムＤＮＡ（組織）および超音波未処理のサケ精巣ＰＤＲＮエクソソームから抽出したＤＮＡ（Ｎｏ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）、超音波を一回処理したサケ精巣ＰＤＲＮエクソソームから抽出したＤＮＡ（Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ１）、超音波処理後に分離したエクソソーム（Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ１）に２次超音波を処理したサケ精子ＰＤＲＮエクソソーム（Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ２）のＤＮＡを１．３％アガロースゲルで３０分間電気泳動した後、分析した。図５Ｂは、サケ精巣からＰＤＲＮエクソソームを超音波条件別に分離してそれぞれのエクソソーム内のＤＮＡの量を比較した。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１。サケ低分子ＰＤＲＮエクソソーム（ｓＰＤＲＮ Ｅｘｏｓｏｍｅ）の細胞生存率の分析結果である。ヒト皮膚角化細胞に超音波を処理してサケ精巣から低分子誘導されたＰＤＲＮエクソソーム（ｓＰＤＲＮ Ｅｘｏｓｏｍｅ）を濃度別に処理して細胞生存率を分析した。２４時間培養後、Ｅｚ－ｃｙｔｏｘ（ＤｏｇｅｎＢｉｏ社製、韓国）を処理し、１時間３０分間反応させた後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。＊ｐ≦０．０５。免疫蛍光法分析による低分子誘導ｓＰＤＲＮエクソソームとＰＤＲＮの細胞吸収率の比較分析結果である。超音波処理済みの（Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）低分子誘導ＰＤＲＮエクソソームの細胞吸収率を確認するために、蛍光標識されたＰＤＲＮおよびＤＩＤで染色された低分子誘導ｓＰＤＲＮエクソソームを免疫蛍光法で分析した。染色されたｓＰＤＲＮエクソソームは、免疫蛍光画像共焦点顕微鏡（ＤＭｉ８、ＬＥＩＣＡ社製）で分析した。フローサイトメトリーを利用した低分子誘導ｓＰＤＲＮエクソソームとＰＤＲＮの細胞内吸収率の比較分析結果である。ＤＩＤで染色された１×１０９個のサケ低分子誘導のエクソソーム（ｓＰＤＲＮエクソソーム）及びＰＤＲＮを、ヒト線維芽細胞にそれぞれ処理して２４時間培養した後、翌日フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＭｅｌｏｄｙＴＭ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で測定し、その結果をフローサイトメトリー分析チャート（図８Ａ）及び測定された値をグラフ（図８Ｂ）で示した。低分子誘導ｓＰＤＲＮエクソソームの組織再生効能の分析結果である。超音波によって低分子誘導されたサケＰＤＲＮエクソソームの組織再生効能をヒト皮膚角化細胞（ＨａＣａＴ）で確認した（図９Ａ）。ヒト皮膚角化細胞でマイグレーション試験を行った。ＴＮＦ－αおよびＩＮＦ－γで炎症反応を２４時間の間誘導した後、培養液（Ｃｏｎｔ）と低分子誘導ＰＤＲＮエクソソーム（ｓＰＤＲＮ ｅｘｏ）、そしてＰＤＲＮを処理して２４時間後に細胞遊走の程度を顕微鏡で測定した（図９Ｂ）。図９Ａの面積をＩｍａｇｅ Ｊ プログラムで定量した。＊＊ｐ≦０．０１。ヒト皮膚角質細胞から低分子誘導されたｓＰＤＲＮエクソソームの抗炎症効能の評価結果である。ヒト皮膚角化細胞にＴＮＦ－αおよびＩＮＦ－γを同時に処理して炎症反応を２４時間の間誘導した後、サケ精巣低分子ｓＰＤＲＮエクソソームを濃度別（図１０Ａ）に、超音波処理条件別に（図１０Ｂ）、２４時間処理して抗炎症反応を分析した。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ ｐ＜０．００１。タラ精巣ＰＤＲＮエクソソームの免疫蛍光画像分析結果である。タラの精巣から抽出したＰＤＲＮエクソソームに対してＰＥ標識抗ＣＤ６３抗体（緑色、Ｈ５Ｃ６、ＰＥ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＴＭ）を用いた免疫蛍光染色およびＤＩＤ染色（赤色、ＶｙｂｒａｎｔＴＭＤＩＤ Ｃｅｌｌ－Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ；Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ社製）を一晩進めた。染色されたＰＤＲＮエクソソームは、免疫蛍光画像共焦点顕微鏡（ＤＭｉ８、ＬＥＩＣＡ社製）で分析し、マージされた画像は、最上側の黄色と分析された。分離したタラ精巣ＰＤＲＮエクソソームのフローサイトメトリー分析結果である。超音波処理済みの（Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）タラ精巣ＰＤＲＮエクソソームにアルデヒド／硫酸塩ラテックスビーズ（Ａｌｄｅｈｙｄｅ／ｓｕｌｆａｔｅ－ｌａｔｅｘ ｂｅａｄｓ）（Ａ３７３０４、Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ社製）を付着した後、ＰＥ標識されたＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）抗体とＡＰＣ標識ＣＤ８１（１Ｄ６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）抗体を用いてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＭｅｌｏｄｙＴＭ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で分析した。タラ低分子ＰＤＲＮエクソソームの粒度分布及び数の分析結果である。タラ精巣ＰＤＲＮエクソソームを超音波条件別に２つのグループに分けてナノサイト（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ）でＰＤＲＮエクソソームの粒度および粒度分布を確認した。＃１：超音波未処理エクソソーム（Ｎｏ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）、＃２：超音波処理済みのエクソソーム（Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）。タラ精巣から超音波条件に応じて分離されたＰＤＲＮエクソソーム数の比較分析結果である。タラ精巣からＰＤＲＮエクソソームを超音波条件別に分離してそれぞれのエクソソームの数を比較した。＊＊＊ｐ≦０．００１。超音波によるタラ精巣低分子ＰＤＲＮエクソソーム内に含まれたＤＮＡ電気泳動及び含量の分析結果である。図１５Ａは、タラ精巣（組織溶解物）から抽出したゲノムＤＮＡ（組織）および超音波未処理のタラ精巣ＰＤＲＮエクソソームから抽出したＤＮＡ（Ｎｏ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）、超音波を一回処理したタラ精巣ＰＤＲＮエクソソームから抽出したＤＮＡ（Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ１）、超音波処理後に分離したエクソソーム（Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ１）に２次超音波を処理したサケ精子ＰＤＲＮエクソソーム（Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ２）のＤＮＡを１．３％アガロースゲルで３０分間電気泳動した後、分析した。図１５Ｂは、タラ精巣からＰＤＲＮエクソソームを超音波条件別に分離してそれぞれのエクソソーム内のＤＮＡの量を比較した。＊＊＊ｐ≦０．００１。タラ低分子ＰＤＲＮエクソソーム（ｃＰＤＲＮ Ｅｘｏｓｏｍｅ）の細胞