JP-2026514638-A - 細胞培養からのウイルス抽出の改善

JP2026514638AJP 2026514638 AJP2026514638 AJP 2026514638AJP-2026514638-A

Abstract

本明細書に提供するのは、宿主細胞の培養物からウイルスを生成する方法である。本方法は、ウイルスに感染した宿主細胞の培養物を提供することと、宿主細胞を、界面活性剤を含む第１のバッファーと接触させ、宿主細胞を第１のバッファーの存在下で第１の期間インキュベートし、それによって細胞溶解物を生成することと、細胞溶解物を、エンドヌクレアーゼを含む第２のバッファーと第２の期間接触させて、宿主細胞核酸を分解することと、ウイルスを収集することと、を含む。

Inventors

トラン，フエ
コフィー，マシュー
ヘイガーマン，アリソン
ボアイエ，ロベール
ティワリ，クリシュナラジ
ラタワ，ジョティ
パテル，メウール
マット，アラン

Assignees

ナショナルリサーチカウンシルオブカナダ

Dates

Publication Date: 20260513
Application Date: 20240419
Priority Date: 20230421

Claims (20)

宿主細胞の培養物からウイルスを生成する方法であって、（ａ）前記ウイルスに感染した宿主細胞の培養物を提供することと、（ｂ）前記宿主細胞を、界面活性剤を含む第１のバッファーと接触させ、前記宿主細胞を前記第１のバッファーの存在下で第１の期間インキュベートし、それによって細胞溶解物を生成することと、（ｃ）前記細胞溶解物を、エンドヌクレアーゼを含む第２のバッファーと第２の期間接触させて、前記宿主細胞核酸を分解することと、（ｄ）前記ウイルスを収集することと、を含む、前記方法。
前記界面活性剤が、非イオン性界面活性剤である、請求項１に記載の方法。
前記非イオン性界面活性剤がＴｗｅｅｎ２０であり、前記第１のバッファーがリン酸塩をさらに含む、請求項２に記載の方法。
前記第１のバッファーが、１０ｍＭ～２５ｍＭのリン酸塩を含む、請求項３に記載の方法。
前記第１のバッファーが、少なくとも２０ｍＭのリン酸塩を含む、請求項３に記載の方法。
前記リン酸塩が、リン酸ナトリウムである、請求項３または４に記載の方法。
前記宿主細胞を前記第１のバッファーの存在下でインキュベートすることは、ｐＨ７．０～８．０で行われる、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
前記宿主細胞を前記第１のバッファーの存在下でインキュベートすることは、ｐＨ８．０で行われる、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
前記第１のバッファーが、０．５％、１．０％、または２．０％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
前記界面活性剤が、オクチルベータ－Ｄ－グルコピラノシド（ＯＧＰ）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－９、またはＴｗｅｅｎ８０である、請求項２に記載の方法。
前記界面活性剤が、デオキシコール酸ナトリウムである、請求項１に記載の方法。
前記第１の期間が、６０、１２０、１８０、または２４０分である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
前記第２の期間が、６０分、９０分、１２０分、１８０分、または２４０分である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
前記エンドヌクレアーゼが、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
前記エンドヌクレアーゼが、１０～２０Ｕ／ｍＬの濃度で前記細胞溶解物に接触する、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞溶解物を前記エンドヌクレアーゼと接触させることは、３０℃～４０℃の温度で行われる、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞溶解物を前記エンドヌクレアーゼと接触させることは、３５℃～３９℃の温度で行われる、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
前記宿主細胞をインキュベートすることは、３０℃～４０℃の温度で行われる、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
前記宿主細胞をインキュベートすることは、３５℃～３９℃の温度で行われる、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
前記第２のバッファーが、ＭｇＣｌ２をさらに含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。

Description

関連出願（複数可）の相互参照本出願は、２０２３年４月２１日に出願された米国仮出願第６３／４６１，２１６号の優先権の利益を主張するものであり、この米国仮出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。電子配列表の参照電子配列表（２０２４－０１３－０２＿ＳＬ．ｘｍｌ、サイズ：７１，０４３バイト、及び作成日：２０２４年４月１６日）の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００は、２０１２年１２月に化学物質の登録、評価、認可、及び制限（ＲＥＡＣＨ）リストに追加され、ＲＥＡＣＨ附属書ＸＩＶの日没日は２０２１年１月２日であった。この日以降、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００は、環境への影響のため、欧州連合での商業生産に使用することができない。したがって、ウイルス医療品の製造においてＴｒｉｔｏｎＸ－１００の使用に代わる代替の界面活性剤を特定する必要がある。ウイルスを含む細胞培養物を１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０及び２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ８．０で２時間インキュベートした後に得られた細胞溶解物を用いて、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）濃度を１０Ｕ／ｍＬから２０Ｕ／ｍＬまで増加させ、６０分から２４０分の間の様々な期間で試験した、清澄化後の残留宿主細胞（ＨＣ）ＤＮＡの結果を示すグラフである。図１は、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ濃度が増加すると、残留ＨＣＤＮＡレベルが、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００細胞溶解で得られたレベルまで低下したことを示す。図１と同じ試験材料を清澄化後２～８℃で一晩（Ｏ／Ｎ）保管した後の残留ＨＣＤＮＡ結果を示すグラフである。図２は、清澄化前に少なくとも９０分間Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ処理し、清澄化後に２～８℃で同様に長期間保存した場合、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ濃度を上昇させると、残留ＨＣＤＮＡレベルがＴｒｉｔｏｎＸ－１００細胞溶解で得られたレベルまで低下したことを示す。図１と同じ試験材料を清澄化後２～８℃で二晩保管した後の残留ＨＣＤＮＡ結果を示すグラフである。図３は、清澄化後に２～８℃で同様に長期間保存した場合、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ濃度を上昇させると、残留ＨＣＤＮＡレベルがＴｒｉｔｏｎＸ－１００細胞溶解で得られたレベルまで低下したことを示す。図１（清澄化後、実線）、図２（清澄化後２～８℃で１回Ｏ／Ｎ保管、破線）、及び図３（清澄化後２～８℃で２回Ｏ／Ｎ保管、点線）と同じ試験材料の総ウイルス粒子力価結果を示すグラフである。１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００で１時間インキュベートして溶解した試験材料と、２０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４に１％のＱＬ３００グレードＴｗｅｅｎ２０の溶解バッファー（ｐＨ８．０）を使用して２時間インキュベートして溶解した試験材料との結果（両方とも１０Ｕ／ｍＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅで６０分間処理）がコントロールとして含まれている。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ濃度を１０Ｕ／ｍＬから２０Ｕ／ｍＬに増加させ、またはＢｅｎｚｏｎａｓｅ処理時間を６０分から２４０分に変更しても、－８０℃で凍結する前に２～８℃で最大２日間一晩保管した場合、総レオウイルス力価（ＨＰＬＣ）に悪影響を与えなかった。ＱＬ：品質レベル。ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を使用した抽出及び精製プロトコル（左側）と本願に記載の抽出及び精製プロトコル（右側）とを示す概略図である。ウイルスによって引き起こされる疾患は多種多様であるため、ウイルス学は集中的に研究されている分野である。ウイルスタンパク質を分離・精製するため、ワクチンを生成するため、または実験室研究用に感染性ウイルスを提供するために、ウイルスを効率的に生産する需要が常にあった。最近、ウイルス療法の新たな開発により、感染性ウイルスの効率的な製造の必要性がさらに高まっている。本明細書では、小規模及び大規模ウイルス生産の両方に適用できる界面活性剤条件を使用して細胞培養からウイルスを抽出するための改良された方法を説明する。この方法は、細胞培養に界面活性剤を添加する抽出ステップを含む。その後、例えば濾過または遠心分離によって、抽出混合物から細胞デブリを除去することができる。得られたウイルス懸濁液は、クロマトグラフィー法によってさらに濃縮され、及び／または濃厚にすることができる。本発明に従って調製されたウイルスは、ウイルスタンパク質の精製、ワクチン接種、宿主細胞への感染、及び臨床投与を含む任意の目的に使用することができる。本明細書に提供される方法は、全体的により高い収率をもたらし、本明細書に提供される界面活性剤は、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００の優れた代替物となるため、ウイルス原薬の製造にとって有利である。この方法はまた、残留する宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤＮＡ）の量を減少させる。本明細書で使用される場合、「接着細胞」は、細胞培養中の培養容器に接着する細胞を指す。接着細胞の例には、培養容器の表面に細胞の単一の層を形成する細胞である単層細胞が含まれる。「浮遊細胞」または「懸濁細胞」は、細胞培養における培養容器に接着しない細胞を指す。懸濁細胞は、「スピン培養」で増殖させることができ、「スピン培養」は、培養プロセス中に培養培地を継続的に攪拌する培養法である。本明細書で使用される「周囲温度」は、約１０℃～約３０℃の間の温度を指す。周囲温度は、好ましくは約１５℃～約３０℃の間、より好ましくは約２０℃～約２５℃の間、最も好ましくは約２５℃である。本明細書で使用される場合、「細胞に結合している」ウイルスは、ウイルスが産生された細胞に接着しているかまたはその一部に捕捉されているウイルスを指す。したがって、ウイルスは、宿主細胞が溶解される前に細胞に結合される。細胞溶解が始まるとき、ウイルスは、破損した細胞の一部にまだ接着しているかまたは捕捉されており、細胞に結合したままになり得る。しかしながら、ウイルスが培地中に自由に放出されると、それはもはや細胞に結合されなくなる。「細胞遊離ウイルス」は、細胞に結合していないウイルスである。本明細書で使用されるとき、「細胞培養物」または「細胞の培養物」とは、その培養条件で見出される培養細胞の集団を意味する。具体的に、細胞培養は、細胞及び培養培地を含む。ペレット化された細胞は、それらが再度培養条件下で培地に置かれない限り、細胞培養とは見なされない。本明細書で使用される、「細胞溶解」とは、細胞の細胞膜の破壊及びその後の細胞の内容物の全てまたは一部の放出を指す。本明細書で使用される場合、物質の「臨床投与」とは、生体の健康状態を改善または維持するために、生体の体の任意の部分を物質と接触させることを指す。本明細書で使用される場合、ウイルスを「収集する」とは、ウイルスに以前に感染した細胞培養物から生成されたウイルスを分離する行為を指す。ウイルスは通常、ウイルスから細胞デブリを分離し、ウイルスを含む部分を採取することによって収集される。任意選択で、ウイルスを、例えば遠心分離によって、可溶性物質からさらに分離することができる。本明細書で使用される場、「培養条件」とは、細胞培養に使用される条件を指し、温度、培養容器の種類、湿度、培養容器内で使用されるＣＯ２またはその他のガスの濃度、培養培地の種類、培養細胞の初期密度、及び細胞がウイルスに感染している場合は、初期の感染多重度などを含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される、「細胞変性効果」とは、感染した宿主細胞に対する損傷である。細胞変性効果は、細胞が腫脹し、外観が粒状になり、細胞塊が崩壊することによって示され得る。細胞変性効果を示す細胞はまた、生細胞数に染色色素を取り込み得る。本明細書で使用される場合、「界面活性剤」は、親水性部分及び疎水性部分を有する物質である。界面活性剤は、好ましくは合成化合物、より好ましくは生分解性の合成化合物である。本発明において有用な界面活性剤は、細胞膜の破壊を増進させて、破壊された細胞の内容物の放出を促進する。本明細書において、細胞が「破壊される」とは、細胞膜が破裂し、細胞の内容物の少なくとも一部が細胞から放出されることを意味する。細胞は、例えば、凍結解凍、超音波処理、または界面活性剤処理によって破壊され得る。本明細書で使用される場合、ウイルスを「抽出する」とは、細胞結合ウイルスを細胞遊離ウイルスに変換する行為を指す。本明細書で使用される場合、「ＨＥＫ２９３細胞」は、２９３と呼ばれるヒト胎児腎細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１５７３）またはその誘導体を指す。例えば、２９３／ＳＦ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１５７３．１）は、無血清培地中で増殖するように適合されたＨＥＫ２９３細胞である。本発明では、他の培養条件で増殖するように適合されたＨＥＫ２９３細胞、または外来ＤＮＡで形質転換されたあらゆる種類のＨＥＫ２９３細胞もしくはその誘導体も想定されるが、この形質転換は、本発明に記載されるような効率的なレオウイルス生成をサポートする細胞の能力を損なわないものとする。本明細書で使用される場合、細胞培養物に界面活性剤を添加した後に「インキュベートすること」とは、細胞培養物を一定期間にわたって界面活性剤と混合させる行為を指す。本明細書で使用される場合、「感染多重度」または「ＭＯＩ」は、ウイルスが細胞に接触させるために使用される場合の細胞数に対するウイルス数の比を指す。本明細書で使用される場合、「非エンベロープウイルス」は、エンベロープを有しないウイルスである。例えば、非エンベロープウイルスは、アデノウイルス科に属する任意のウイルス（例えば、アデノウイルス）、ピコルナウイルス科に属する任意のウイルス（例えば、ポリオウイルス）、レオウイルス科に属する任意のウイルス（例えば、レオウイルス）、パポバルウイルス科に属する任意のウイルス（例えば、パピローマウイルス）、パルボウイルス科に属する任意のウイルス（例えば、キルハムラットウイルス）、またはイリドウイルス科に属する任意のウイルス（例えば、ガガンボ‐イリデッセントウイルス）であり得る。本明細書で使用される、「細胞の生存率」または「生存している細胞の割合」は、集団内で細胞変性効果を示さない細胞の割合である。本明細書で使用される場合、「ウイルス感染」とは、細胞内へのウイルスの侵入及びその後の細胞内でのウイルスの複製を指す。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、実験誤差、測定誤差、及び当業者によって予想されるばらつきを考慮に入れるために使用され得る。例えば、「約」は、言及されている示された値のプラスもしくはマイナス１０％、またはプラスもしくはマイナス５％を意味し得る。本明細書に提供するのは、宿主細胞の培養物からウイルスを生成する方法である。本方法は、ウイルスに感染した宿主細胞の培養物を提供することと、宿主細胞を、界面活性剤を含む第１のバッファーと接触させ、宿主細胞を第１のバッファーの存在下で第１の期間インキュベートし、それによって細胞溶解物を生成することと、を含む。次に、細胞溶解物が、エンドヌクレアーゼを含む第２のバッファーに第２の期間接触して宿主細胞核酸を分解し、その後にウイルスの収集が続く。界面活性剤は、非イオン性界面活性剤または陰イオン性界面活性剤であってもよい。非イオン性界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリソルベート２０）、オクチルベータ－Ｄ－グルコピラノシド（ＯＧＰ）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）１５－Ｓ－９（ポリエチレングリコールトリメチルノニルエーテルとも呼ばれるＣ１２－１４第二アルコールエトキシレート）、またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０（ポリソルベート８０）であってもよい。陰イオン性界面活性剤は、デオキシコール酸ナトリウムであってもよい。界面活性剤は、０．５％～２．０％（ｖ／ｖ）の濃度で、または０．５％～２．０％（ｖ／ｖ）の間の任意の量で存在し得る。したがって、例えば、バッファー中の界面活性剤の濃度は、０．５％、０．６％、０．７％、０．８