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JP-2026514655-A - 補酵素Ａによる生産物阻害が低減されたパントテン酸キナーゼの遺伝子を発現する微生物におけるビオチン生産

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Abstract

本発明は、ビオチン、デスチオビオチン（ＤＴＢ）又はそれらの混合物の製造方法に関し、該方法は、補酵素Ａに対してフィードバック耐性であり、かつパントテン酸キナーゼの酵素活性（クラスＥＣ ２．７．１．３３のタンパク質の酵素活性）を有する、少なくとも１つの酵素を遺伝子組換え的に発現する微生物生産株を培養し、次いでビオチン若しくはＤＴＢ又はそれらの混合物を単離することを特徴とする。

Inventors

  • プファラー，ルーペルト
  • ゾマー，カリーナ

Assignees

  • ワッカー ケミー アクチエンゲゼルシャフト

Dates

Publication Date
20260513
Application Date
20231024

Claims (15)

  1. 補酵素Ａに対してフィードバック耐性であり、かつパントテン酸キナーゼの酵素活性（クラスＥＣ ２．７．１．３３、ＣｏａＡのタンパク質の酵素活性）を有する、少なくとも１つの酵素を遺伝子組換え的に発現する微生物生産株を培養し、次いでビオチン、ＤＴＢ又はそれらの混合物を単離することを特徴とする、ビオチン、デスチオビオチン（ＤＴＢ）又はそれらの混合物の製造方法。
  2. 前記微生物生産株が細菌株であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 前記微生物生産株が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）種、ラウルテラ・テリジェナ（Raoultella terrigena）種又はパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）種の株であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記微生物生産株が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）種の株であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記細胞を、発酵により工業的規模で培養することを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 補酵素Ａに対してフィードバック耐性であり、かつパントテン酸キナーゼの酵素活性を有する前記酵素を発現する遺伝子が、その野生型において補酵素Ａによってフィードバック阻害されるＣｏａＡ酵素をコードする変異遺伝子であることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 補酵素Ａに対してフィードバック耐性であり、かつパントテン酸キナーゼの酵素活性を有する酵素を発現する前記変異遺伝子が、細菌遺伝子であることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 補酵素Ａに対してフィードバック耐性であり、かつパントテン酸キナーゼの酵素活性を有する酵素を発現する前記変異遺伝子が、エンテロバクター科（Enterobacteriaceae）由来の細菌遺伝子であることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 補酵素Ａに対してフィードバック耐性であり、かつパントテン酸キナーゼの酵素活性を有する酵素を発現する前記変異遺伝子が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）由来のｃｏａＡ遺伝子であることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 補酵素Ａに対してフィードバック耐性であり、かつパントテン酸キナーゼの酵素活性を有する前記酵素が、配列番号４、配列番号６若しくは配列番号８のアミノ酸配列、又は少なくとも７０％が同一であるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記酵素が、配列番号４のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
  12. 発酵バッチ中のビオチンの含有量に対して、培養上清中のビオチンの含有量が７０％超であることを特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 最大６５時間の発酵時間の後、発酵終了時のビオチンの収量が少なくとも１０ｍｇ／Ｌであることを特徴とする、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 最大６５時間の発酵時間の後、発酵終了時のＤＴＢの収量が少なくとも１０ｍｇ／Ｌであることを特徴とする、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. ＤＴＢが生産され、生物変換においてビオチンに変換され、次いで該ビオチンが該生物変換反応から単離されることを特徴とする、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。

Description

本発明は、ビオチン、デスチオビオチン（ＤＴＢ）又はそれらの混合物を製造する方法を提供し、該方法は、補酵素Ａに対してフィードバック耐性であり、かつパントテン酸キナーゼの酵素活性（クラスＥＣ ２．７．１．３３のタンパク質の酵素活性）を有する、少なくとも１つの酵素を遺伝子組換え的に発現する微生物生産株を培養し、次いでビオチン若しくはＤＴＢ又はそれらの混合物を単離することを特徴とする。 ビオチン（Ｄ－ビオチン、ビタミンＢ７、ビタミンＨ、ＣＡＳ番号５８－８５－５）は、ビタミンＢ群に属する水溶性ビタミンである。補欠分子族として、それは細胞代謝において重要な役割を果たし、そこでカルボキシル化反応において本来不活性なＣＯ２を活性化する。ビオチン依存性酵素の例としては、マロニル－ＣｏＡ合成酵素、プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ及びゲラニル－ＣｏＡカルボキシラーゼが挙げられる。ビオチンは、栄養補助食品及び飼料の添加物として、化粧品において、並びに製薬分野において、経済的に非常に重要なビタミンである。 デスチオビオチン（ＤＴＢ、ＣＡＳ番号５３３－４８－２）は、ビオチンの生合成前駆体である。ビオチンは、ＤＴＢへの硫黄の酵素触媒による取り込みによって形成される。ビオチンの微生物生合成及びその生合成の調節は公知である（Ｓｉｒｉｔｈａｎａｋｏｒｎ及びＣｒｏｎａｎによる総説、２０２１年、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４５巻：ｆｕａｂ００３を参照）。微生物におけるビオチンの生合成は厳密に調節されており、その結果、機能的なビオチン生合成経路を有する野生型株ではビオチンを検出することができない（本発明の実施例も参照）。機能的なビオチン生合成経路の証拠は、野生型株がビオチンを添加しない最少培地（定義された無機塩培地）で増殖できるのに対し、該株のビオチン要求性変異体は同じ条件下では増殖できないという事実によって提供される。したがって、微生物におけるビオチン生産の検出の欠如は、それがビオチンを生産できないことを意味するのではなく、ビオチン生合成が厳密な調節を受けていること、及び微生物によって合成されたビオチンが関連する酵素に補因子として直ちに取り込まれ、遊離の形態ではないことを意味する。加えて、微生物は環境からビオチンを吸収することができ、例えば増殖培地からの十分なビオチン供給があった場合、微生物にとって代謝的にコストのかかるビオチン合成は完全に停止される。したがって、十分な外部供給がある場合、野生型株は自身のビオチンを生産しない。 ビオチン生合成の調節に関する先行技術は、Ｓｉｒｉｔｈａｎａｋｏｒｎ及びＣｒｏｎａｎによって詳細に記載されている。微生物がその生存能力に必要なだけのビオチンを生産することを確実にするこのビオチン生合成の厳密な調節は、これまでビオチンを製造するための経済的に競争力のあるバイオテクノロジー的方法の開発を妨げてきた。 パントテン酸（ビタミンＢ５、Ｒ体についてはＣＡＳ番号７９－８３－４、ラセミ体についてはＣＡＳ番号５９９９－５４－２、Ｃａ塩についてはＣＡＳ番号１３７－０８－６）は、補酵素Ａ（ＣｏＡ）の重要な生合成前駆体であり、ＣｏＡは代謝においてアシル基の活性化のために（例えば、クエン酸回路、脂肪酸合成又は脂肪酸酸化におけるアセチル－ＣｏＡ、スクシニル－ＣｏＡ又はマロニル－ＣｏＡとして）使用される。ＣｏＡの生合成は公知である（Ｌｅｏｎａｒｄｉ及びＪａｃｋｏｗｓｋｉによる総説、２００７年、ＥｃｏＳａｌ Ｐｌｕｓ、２巻を参照）。補酵素Ａは、パントテン酸から５つの酵素段階を経て生産される。補酵素Ａ生合成の第１段階である、パントテン酸のＡＴＰ依存性リン酸化による４’－ホスホパントテン酸の形成は、式（１）に従って酵素パントテン酸キナーゼ（ＥＣ ２．７．１．３３、ＣｏａＡ、ＣｏａＡ酵素又はＰａｎＫと称される）によって触媒される。 式（１）： （Ｒ）－パントテン酸＋ＡＴＰ＜＝＞（Ｒ）－４’－ホスホパントテン酸＋ＡＤＰ＋Ｈ＋ 細菌では３種類のＣｏａＡ酵素が知られている；Ｈｏｎｇら（２００６年）、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １４巻：１２５１～１２６１頁を参照。Ｉ型ＣｏａＡは、例えば、大腸菌（エシェリヒア・コリ（Escherichia coli））由来の酵素によって代表される。Ｉ型ＣｏａＡの活性は、補酵素Ａ又はそのＣｏＡ－チオエステルによってフィードバック阻害される。ＩＩ型ＣｏａＡ酵素は、フィードバック阻害されない黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）酵素によって代表される。ＩＩＩ型ＣｏａＡ酵素は、同様にフィードバック阻害されない緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）酵素によって代表される。ＩＩ型及びＩＩＩ型ＣｏａＡ酵素を有する微生物は、主として病原性細菌であり、その遺伝子は代謝工学において可能な限り避けるべきである。Ｉ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型ＣｏａＡ酵素がビオチン合成に影響を与えるかどうかに関するこれまでの研究はない。 大腸菌において、Ｉ型ＣｏａＡを代表する酵素パントテン酸キナーゼは、ｃｏａＡ遺伝子によってコードされる。ＣｏａＡ酵素の活性は、生合成経路の最終産物である補酵素Ａによって阻害される。したがって、補酵素ＡはＣｏａＡ酵素の阻害剤である。大腸菌のような微生物では、この形態の生産物阻害（フィードバック阻害）は多くの代謝経路に特徴的であり、微生物がその生物によって必要とされるだけの代謝物（この場合は補酵素Ａ）を生産することを保証する。したがって、補酵素Ａ生合成にとって、パントテン酸キナーゼが重要な酵素である。 大腸菌由来のＣｏａＡ酵素のタンパク質構造を調べることから、Ｒｏｃｋら（２００３年）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８５巻：３４１０～３４１５頁は、補酵素Ａの結合に必須であり、したがって補酵素ＡによるＣｏａＡ酵素活性の阻害を媒介する３つのアミノ酸を同定している（Ｒｏｃｋらにおける図２参照）。その３つのアミノ酸は、１０６位のアルギニン（Ｒ１０６）、１７７位のヒスチジン（Ｈ１７７）及び２４７位のフェニルアラニン（Ｆ２４７）である。別の補酵素Ａ相互作用アミノ酸であるタンパク質配列の１０１位のリジンは、酵素活性に必須のＡＴＰ基質の結合に関与しており、その変異は不活性な酵素をもたらす。 Ｒｏｃｋらによる研究の目的は、補酵素Ａによる酵素活性のフィードバック阻害が低減されたＣｏａＡ酵素の変異体を生産することであった。本発明において、「低減されたフィードバック阻害」という表現は、「増加したフィードバック耐性」という表現と同義的に使用される（フィードバック耐性はｆｂｒと略される）。本発明において、補酵素Ａに対してフィードバック耐性であるパントテン酸キナーゼの変異体は、したがって、ＣｏａＡ酵素又はパントテン酸キナーゼのｆｂｒ変異体とも称される。 Ｒｏｃｋらによる図４Ａによれば、野生型ＣｏａＡ酵素は、２０μＭの補酵素Ａの存在下でのその酵素活性が、補酵素Ａを全く添加しない野生型ＣｏａＡ酵素の活性の約４０％にのみ相当することを特徴とする。したがって、補酵素Ａは野生型ＣｏａＡ酵素の阻害剤である。いわゆる阻害剤定数ＩＣ５０は、酵素の活性が阻害剤非存在下での活性の５０％にすぎないときの阻害剤の濃度を示す。Ｒｏｃｋらによる図４Ａによれば、大腸菌由来のＣｏａＡ酵素のＩＣ５０は、したがって２０μＭの補酵素Ａ未満である。 ＣｏａＡ酵素の３つの点変異体、すなわちアミノ酸が変異したＲ１０６（ｆｂｒ変異体ＣｏａＡ［Ｒ１０６Ａ］）、Ｈ１７７（ｆｂｒ変異体ＣｏａＡ［Ｈ１７７Ｑ］）又はＦ２４７（ｆｂｒ変異体ＣｏａＡ［Ｆ２４７Ｖ］）は、補酵素Ａに対する生産物阻害の喪失によって区別された（Ｒｏｃｋらにおける図２及び図４Ａ参照）。ｆｂｒ変異体は、その酵素的特性に関して特徴付けられた。フィードバック耐性ＣｏａＡ変異体の過剰発現（補酵素Ａ生合成経路の脱調節に相当）の生理学的効果の研究により、大腸菌細胞における４’－ホスホパンテテインや補酵素Ａなどのリン酸化代謝物の蓄積が明らかになった（Ｒｏｃｋらにおける図６）。したがって、Ｒｏｃｋらによって研究されたのは、フィードバック耐性ＣｏａＡ変異体の発現が、大腸菌における４－ホスホパンテテインや補酵素Ａなどの様々なリン酸化パントテン酸由来代謝物の含有量にどのように影響するかであった。ＥＰ ３ ２６９ ８１９ Ｂ１は、Ｏ－アセチルホモセリンの生産にフィードバック耐性ＣｏａＡ変異体を使用している。ビオチンの生産に関する研究は、Ｒｏｃｋらによっても、ＥＰ ３ ２６９ ８１９ Ｂ１においても実施されなかった。補酵素Ａとビオチンの代謝経路との間には、機構的な関連性はない。 ビオチンの商業的利用のために、この化合物は現在、化学的に生産されている。フマル酸から出発する１３段階の合成が知られている。化学的に生産された成分を遠ざけるという消費者主導の傾向があるため、ビオチンを生産するためのバイオテクノロジー的方法は大きな関心を集めている。 ビオチン生産株を生産するための公知のバイオテクノロジー的アプローチ（Ｓｉｒｉｔｈａｎａｋｏｒｎ及びＣｒｏｎａｎも参照）は、主として、ビオチンのための様々な生合成遺伝子、すなわち遺伝子ｂｉｏＡ、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＣ、ｂｉｏＤ、ｂｉｏＦ及びｂｉｏＨ、又はそれらの機能的に類似する遺伝子の組換え発現に焦点を当てている。さらに、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を用いて、変異誘発及び選択によってビオチン生産が改善された微生物株を単離した（Ｂａｌｉら、２０２０年、Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．６０巻：９７～１０７頁）。 したがって、先行技術は、微生物生産からビオチンを得るための様々な代謝工学及びＨＴＳアプローチを開示している。これらすべてのアプローチで達成された成功は限定的であったため、現在のところ、化学合成が、商業目的でビオチンを生産するための選択方法であり続けている。公知のバイオテクノロジー的アプローチがこれまで不適切であったことは、ビオチンの生産のためのバイオテクノロジー的方法を改善することができる新規な遺伝的要素の必要性があることを意味する。 欧州特許第３２６９８１９号明細書 Sirithanakorn and Cronan, 2021, FEMS Microbiol. Rev. 45: fuab003Leonardi and Jackowski, 2007, EcoSal Plus, 2Hong et al. (2006), Structure 14: 1251-1261Rock et al. (2003), J. Bacteriol 185: 3410-3415Bali et al., 2020, Metab. Eng. 60:97-107 先行技術から知られているように（上記参照）、本発明においても、未改変の野生型微生物は検出可能なビオチンを生産しないことが見出された（本発明の実施例５～７参照）。ビオチン及び生合成前駆体ＤＴＢは、細胞内でも細胞外でも検出できなかった（実施例８参照）。しかしながら、驚くべきことに、組換えフィードバック耐性ｃｏａＡ変異体の発現による補酵素Ａ生合成経路の脱調節の結果として、微生物におけるビオチン生産が可能になることが見出された。このビオチン生合成経路の脱調節は、特に野生型微生物株が使用できないため、代謝工学によるビオチン生産のためのバイオテクノロジー的方法の開発にとって大きな関心事である。 生産株において遺伝子組換え的に発現され、補酵素Ａに対してフィードバック耐性であり、かつパントテン酸キナーゼの酵素活性（クラスＥＣ ２．７．１．３３のタンパク質の酵素活性）を有する酵素を発現する遺伝子は、 １．補酵素Ａによってフィードバック阻害されないＣｏａＡ酵素をコードする野生型遺伝子（例えば、ＩＩ型又はＩＩＩ型パントテン酸キナーゼをコード