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JP-2026514663-A - ＴＮＦスーパーファミリーメンバー免疫サイトカイン及びその使用

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Abstract

開示は、抗体－サイトカイン融合タンパク質、特にＴＮＦスーパーファミリーメンバー融合タンパク質（免疫サイトカイン）及びその使用に関する。融合タンパク質は抗腫瘍活性を示す。本開示は、腫瘍特異的サイトカイン送達のための抗体－サイトカイン融合タンパク質プラットフォームを提供する。プラットフォームは正しいアセンブリを達成し、プラットフォームから生成された分子は、腫瘍微小環境におけるＴ細胞及びＢ細胞領域の堅固な形成を示し、有望な抗腫瘍効果をもたらす。

Inventors

  • ジャイ， チャンティン
  • ヤン， マイユン
  • フェイ， ミンジャン
  • スン， ルンジ
  • ファン， シャオドン

Assignees

  • ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド

Dates

Publication Date
20260513
Application Date
20240322
Priority Date
20230323

Claims (20)

  1. 融合タンパク質であって、 第１のサイトカイン分子、又はタンデムに連結された第１のサイトカイン分子及び第３のサイトカイン分子を含む、第１のＣＨ２－ＣＨ３断片のＣ末端に連結された第１のサイトカイン断片、及び 第２のサイトカイン分子、又はタンデムに連結された第２のサイトカイン分子及び第４のサイトカイン分子を含む、第２のＣＨ２－ＣＨ３断片のＣ末端に連結された第２のサイトカイン断片 を含み、 前記第１のＣＨ２－ＣＨ３断片及び前記第２のＣＨ２－ＣＨ３断片が二量体を形成し、合計３つのサイトカイン分子が前記二量体に連結される、融合タンパク質。
  2. 前記第１のサイトカイン断片が前記第１のサイトカイン分子を含み、前記第２のサイトカイン断片がタンデムに連結された前記第２のサイトカイン分子及び前記第４のサイトカイン分子を含むか、又は 前記第１のサイトカイン断片が、タンデムに連結された前記第１のサイトカイン分子及び第３のサイトカイン分子を含み、前記第２のサイトカイン断片が、前記第２のサイトカイン分子を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 前記第１のサイトカイン分子、前記第２のサイトカイン分子、前記第３のサイトカイン分子及び前記第４のサイトカイン分子が、独立して、腫瘍壊死因子、インターロイキン、リンホカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子、ケモカイン及び成長因子からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
  4. 前記第１のサイトカイン分子、前記第２のサイトカイン分子、前記第３のサイトカイン分子及び前記第４のサイトカイン分子が、独立して、ＬＩＧＨＴ、リンホトキシンα、リンホトキシンβ又は４－１ＢＢＬである、請求項１～３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  5. 前記第１のサイトカイン分子、前記第２のサイトカイン分子、前記第３のサイトカイン分子及び前記第４のサイトカイン分子が、独立して、野生型ＬＩＧＨＴ（好ましくはヒトＬＩＧＨＴ）、切断型ＬＩＧＨＴ又はそのムテインであり、場合により、野生型ＬＩＧＨＴ、切断型ＬＩＧＨＴ又はそれらのムテインが、配列番号２５、２６、５８、５９、６８～７８、１２６～１４１、１５８、１７７、１７８及び１８０のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、 前記第１のサイトカイン分子、前記第２のサイトカイン分子、前記第３のサイトカイン分子及び前記第４のサイトカイン分子が、独立して、野生型４－１ＢＢＬ（好ましくはヒト４－１ＢＢＬ）、切断型４－１ＢＢＬ又はそれらのムテインであり、場合により、野生型４－１ＢＢＬ、切断型４－１ＢＢＬ又はそれらのムテインは、配列番号１７９のアミノ酸配列を含み、 前記第１のサイトカイン分子、前記第２のサイトカイン分子、前記第３のサイトカイン分子及び前記第４のサイトカイン分子が、独立して、野生型、切断型リンホトキシンα若しくはリンホトキシンβ、又はそれらのムテインであり、場合により、野生型、切断型リンホトキシンα若しくはリンホトキシンβ、又はそれらのムテインが、配列番号１８１、１８２のアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  6. 前記第１のサイトカイン分子、前記第２のサイトカイン分子、前記第３のサイトカイン分子及び前記第４のサイトカイン分子が、独立して、切断型ＬＩＧＨＴであり、場合により、前記切断型ＬＩＧＨＴが、配列番号６８又は配列番号７８に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  7. 前記第１のサイトカイン分子、前記第２のサイトカイン分子、前記第３のサイトカイン分子及び前記第４のサイトカイン分子が、独立して、ＬＩＧＨＴムテインであり、場合により、前記ＬＩＧＨＴムテインは、配列番号２５～２６、５８～５９、６９～７７、１２６～１４１、１５８、１７７、１７８及び１８０のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  8. 前記二量体が、前記融合タンパク質の正しいアセンブリを改善するように修飾されたＦｃドメインである、請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  9. 前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含むＩｇＧに由来し、場合により前記ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインに由来する、請求項８に記載の融合タンパク質。
  10. 前記第１のＣＨ２－ＣＨ３断片及び前記第２のＣＨ２－ＣＨ３断片が、ノブス・イントゥ・ホール、ＣＨ３の静電ステアリング（ＤＤＫＫ等）、ＤｕｏＢｏｄｙ、ＳＥＥＤｂｏｄｉｅｓ、ｃＦＡＥ、ＸｍＡｂ、Ａｚｙｍｅｔｒｉｃ及びＢＥＡＴ（登録商標）からなる群から選択される１つ以上の改変を含み、 場合により、前記改変が、ノブス・イントゥ・ホール及び／又はＤＤＫＫを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  11. 前記第１のＣＨ２－ＣＨ３断片及び前記第２のＣＨ２－ＣＨ３断片が、変異Ｎ２９７Ａを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを形成する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  12. 前記第１のＣＨ２－ＣＨ３断片又は前記第２のＣＨ２－ＣＨ３断片が、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖからなる群から選択される１つ以上の変異を更に含み、他方は変異Ｓ３５４Ｃ及び／又はＴ３６６Ｗを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  13. 前記第１のサイトカイン断片が、前記第１のＣＨ２－ＣＨ３断片のＣ末端に直接又はリンカーを介して連結している、及び／又は 前記第２のサイトカイン断片が、前記第２のＣＨ２－ＣＨ３断片のＣ末端に直接又はリンカーを介して連結している、請求項１～１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  14. 前記第１のＣＨ２－ＣＨ３断片の前記ＣＨ３ドメインのＣ末端が、直接又は第１のリンカーＡを介して、前記第１のサイトカイン断片のＮ末端に融合される、及び／又は前記第２のＣＨ２－ＣＨ３断片のＣＨ３ドメインのＣ末端は、直接又は第１のリンカーＢを介して前記第２のサイトカイン断片のＮ末端に融合される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  15. 前記第１のサイトカイン分子が、前記第３のサイトカイン分子に直接又は第２のリンカーＡを介して融合される、及び／又は 前記第２のサイトカイン分子が、前記第４のサイトカイン分子に直接又は第２のリンカーＢを介して融合される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  16. 前記第１のサイトカイン分子の前記Ｃ末端が、直接又は第２のリンカーＡを介して、前記第３のサイトカイン分子の前記Ｎ末端に融合される、及び／又は前記第２のサイトカインのＣ末端が、直接又は第２のリンカーＢを介して、前記第４のサイトカインのＮ末端に融合される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  17. 前記第１のリンカーＡ、前記第１のリンカーＢ、前記第２のリンカーＡ、及び前記第２のリンカーＢが独立して存在しないか、又はＶＨ－ＣＨ１リンカー（配列番号８２）、ＶＬ－ＣＬリンカー（配列番号８３）、ＣＨ２－ＣＨ３リンカー（配列番号８１）、ＩｇＭテールリンカー（配列番号８４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴ（配列番号８９）、Ｇ、及び（ＧＧＧＧＳ）ｎからなる群から選択され、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０であり、 場合により、前記第１のリンカーＡ及び前記第１のリンカーＢは独立して存在しないか、又は配列番号８１、８２、８３、８４及び８９、Ｇ、及び（ＧＧＧＧＳ）ｎからなる群から選択され、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  18. 前記第１のリンカーＡ及び前記第１のリンカーＢが独立して存在しないか、又は配列番号８１～９０のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  19. 前記第１のリンカーＡ及び前記第１のリンカーＢが同じ又は異なる、請求項１～１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  20. 前記第２のリンカーＡ及び前記第２のリンカーＢが独立して存在しないか、Ｇ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴ又は（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

Description

本開示は、生物医学又は生物製剤の技術分野に関し、抗体－サイトカイン融合タンパク質、特にＴＮＦスーパーファミリーメンバー融合タンパク質（免疫サイトカイン）及びその使用に関する。 このセクションの記述は、本開示に関連する背景情報を提供するにすぎず、必ずしも先行技術を構成するものではない。 サイトカインは、炎症を調節し、細胞活性を調節する細胞シグナル伝達分子として作用する低分子タンパク質（５～２０ｋＤａ）のクラスである。それらは異なるファミリーに属し、免疫細胞を誘引し刺激する、抗体産生を誘導する、及びリンパ節形成を促進する等の異なる機能を有し得る。サイトカインは、その受容体の構造的類似性又は構造的類似性に基づいてファミリーに分類される、炎症誘発性又は抗炎症性因子の膨大で多様な群である。サイトカインには、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、ホルモン、成長因子等が含まれる。 ＬＩＧＨＴ（リンホトキシンと相同であり、誘導性発現を示し、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄと、Ｔ細胞によって発現される受容体であるヘルペスウイルス侵入メディエーターについて競合する）としても公知のＴＮＦＳＦ１４（ＴＮＦスーパーファミリーメンバー１４）は、ＴＮＦＲＳＦ１４（ＨＶＥＭとしても知られるＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１４）及びＬＴβＲ（リンホトキシンβ受容体）並びにデコイ受容体ＤｃＲ３に結合することができる誘導性炎症性サイトカインである。ＨＶＥＭは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及び樹状細胞等の様々な免疫細胞の表面に発現される。ＬＩＧＨＴはＨＶＥＭに結合し、続いてＴ細胞を刺激し、炎症を促進することができる。別の受容体ＬＴβＲは、上皮細胞、間質細胞、未成熟ＤＣ細胞及び他の骨髄系細胞の表面上に発現されるが、リンパ球上には発現されない。ＬＴβＲシグナル伝達の活性化は、免疫細胞の動員及び組織化にとって重要であり、リンパ器官及び三次リンパ系構造（ＴＬＳ）の発達をもたらす。ＴＬＳは、Ｂ細胞領域及びＴ細胞領域、樹状細胞、並びに他の免疫細胞からなり、腫瘍組織におけるそれらの存在は、乳癌、肺癌、及び結腸癌を含む様々な癌適応症における臨床転帰の改善に関連しており、ＴＬＳが癌に対する免疫応答において重要な役割を果たし得ることを示唆している。 サイトカインベースの免疫療法は、癌の治療において有望な効果を示しているが、全身性免疫応答及び重篤な副作用をもたらし得る腫瘍組織の標的化における特異性の欠如に悩まされている。潜在的な解決策は、サイトカインを腫瘍標的化特異性を有する抗体とコンジュゲートさせることである。例えば、３つのｈｍＬＩＧＨＴコピーをＦｃのＮ末端に融合し、次いで、抗ＥＧＦＲ半体とアセンブルした（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。第２の研究では、ＬＩＧＨＴを様々なフォーマットで抗フィブロネクチンＦ８抗体にコンジュゲートした。例えば、タンデムに連結された３つのマウスＬＩＧＨＴコピーを、ｍＡｂ又はｓｃＦｖの重鎖又は軽鎖のＣ末端に融合した。いくつかの抗体－ＬＩＧＨＴフォーマットが評価されているにもかかわらず、タンデム連結マウスＬＩＧＨＴを一本鎖ダイアボディに連結した場合にのみ、有意な凝集を伴わない堅牢なタンパク質発現が観察された（Ｓｔｒｉｎｇｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。更に、血管標的化ペプチド（ＶＴＰ）と融合したマウスＬＩＧＨＴは、固形腫瘍においてリンパ系新生物を誘導することが示されている（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ－Ｐｅｒｃｉｖａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。しかしながら、これらのフォーマットの多くは、精彩を欠く効率又は困難な製造プロセスのために臨床診療に制限がある。したがって、潜在的な毒性を軽減するための強固な製造及び腫瘍特異的サイトカイン送達のための抗体－サイトカイン融合タンパク質プラットフォームを提供する継続的な必要性がある。 以下は、図面の簡単な説明であり、これらは、本明細書に開示される例示的な実施形態を説明する目的で提示され、それを限定することを目的としていない。 評価された様々なフォーマットのＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカインを示す。 フォーマットＤのＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカインのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。分析は、還元（Ｒ）及び非還元（ＮＲ）条件下で実施し、比較のためにタンパク質マーカー（Ｍ）を含めた。 それぞれ一段階プロテインＡ精製後のＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカインＡＢＣ２３３及びＡＢＣ２３４のＨＰＬＣ分析を示す。 それぞれ一段階プロテインＡ精製後のＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカインＡＢＣ２３３及びＡＢＣ２３４のＨＰＬＣ分析を示す。 それぞれ、ＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカインの概略フォーマット及びＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカインの拡張設計を示す。 それぞれ、ＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカインの概略フォーマット及びＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカインの拡張設計を示す。 還元（Ｒ）及び非還元（ＮＲ）条件下でのＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカイン（Ａ～Ｄ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析をタンパク質マーカー（Ｍ）と共に示す。 精製後のＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカインＡＢＣ５３８及びＡＢＣ５３９のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を示す。 精製後のＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカインＡＢＣ７７０－ＡＢＣ７７３のＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析を示す。 ヒトＬＴβＲ細胞外ドメインに結合するＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカイン（Ａ～Ｅ）のＥＬＩＳＡ分析を示す（ｎ＝２）。 マウスＬＴβＲ細胞外ドメインに結合するＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカイン（Ａ～Ｅ）のＥＬＩＳＡ分析を示す（ｎ＝２）。 ヒトＨＶＥＭ細胞外ドメインに結合するＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカインのＥＬＩＳＡ分析を示す。 ヒトＨＶＥＭ細胞外ドメインに結合するＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカインのＥＬＩＳＡ分析を示す。 ヒトＨＶＥＭ細胞外ドメインに結合するＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカインのＥＬＩＳＡ分析を示す。 ヒトＨＶＥＭ細胞外ドメインに結合するＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカインのＥＬＩＳＡ分析を示す。 マウスＨＶＥＭ細胞外ドメインに結合するＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカインのＥＬＩＳＡ分析を示す。 マウスＨＶＥＭ細胞外ドメインに結合するＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカインのＥＬＩＳＡ分析を示す。 マウスＨＶＥＭ細胞外ドメインに結合するＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカインのＥＬＩＳＡ分析を示す。 マウスＨＶＥＭ細胞外ドメインに結合するＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカインのＥＬＩＳＡ分析を示す。 ヒトＤｃＲ３に結合するＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカイン（Ａ～Ｆ）のＥＬＩＳＡ分析を示す。 ヒトＬＴβＲを過剰発現する２９３Ｔ細胞へのＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカイン（Ａ～Ｇ）の結合を示す。平均蛍光強度（ＭＦＩ）及び濃度（Ｃｏｎｃ．）が示されている。 マウスＬＴβＲを過剰発現する２９３Ｔ細胞へのＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカイン（Ａ～Ｇ）の結合を示す。ＭＦＩ：平均蛍光強度。 ヒトＨＶＥＭを過剰発現する２９３Ｔ細胞へのＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカイン（Ａ～Ｄ）の結合を示す。ＭＦＩ：平均蛍光強度。 マウスＨＶＥＭを過剰発現する２９３Ｔ細胞へのＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカイン（Ａ～Ｄ）の結合を示す。ＭＦＩ：平均蛍光強度。 ＦＡＰを過剰発現する２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ－ＦＡＰ）の非存在下（図１６Ａ～図１６Ｄ）及び存在下（図１６Ｅ～図１６Ｈ）におけるＨｅＬａ－ＮＦ－κＢ細胞上のＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカインによって誘導されるＮＦ－κＢ活性を例示する。相対的ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）が報告されている。 ヒトＨＶＥＭを過剰発現する２９３Ｔ－ＮＦ－κＢ細胞上のＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカイン（Ａ～Ｃ）によって誘導されるＮＦ－κＢ活性を示す。相対的ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）が報告されている。 マウスＨＶＥＭを過剰発現する２９３Ｔ－ＮＦ－κＢ細胞上のＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカイン（Ａ～Ｃ）によって誘導されるＮＦ－κＢ活性を実証する。相対的ルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）が報告されている。 ２９３Ｔ－ＦＡＰ細胞の非存在下及び存在下におけるＨｅＬａ－ＮＦ－κＢ細胞上のＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカイン（Ａ～Ｄ）によって誘導されるＮＦ－κＢ活性を示す。 ＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカイン（Ａ～Ｄ）の活性に対するＤｃＲ３の影響を実証している。 ＢＡＬＢ／ｃ－３Ｔ３細胞（図２１Ａ）及びＦＡＰを過剰発現するＢＡＬＢ／ｃ－３Ｔ３細胞（図２１Ｂ）へのＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカインの結合を示す。 初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（図２２Ａ）、初代ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞（図２２Ｂ）、初代マウスＣＤ４＋Ｔ細胞（図２２Ｃ）及び初代マウスＣＤ８＋Ｔ細胞（図２２Ｄ）へのＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカインの結合を示す。 ＢＡＬＢ／ｃ－３Ｔ３－ＷＴ（野生型）細胞（図２３Ａ）及びＢＡＬＢ／ｃ－３Ｔ３－ＦＡＰ細胞（図２３Ｂ）における、ＬＩＧＨＴベースの免疫サイトカインによるＣＣＬ２の誘導を示す。図２３Ｃは、異なる分子によってグループ化された同じ結果を示す。 ＡＢＣ２３３（図２４Ａ）、ＡＢＣ５３８（図２４Ｂ）又はＡＢＣ５３９（図２４Ｃ）を加えたときの、ＣＴ２６－ＦＡＰ又はＣＴ２６－ＷＴの存在下における３Ｔ３細胞上のＬＴβＲのトランス活性化を示す。 ＣＴ２６－ＦＡＰモデルにおける抗ＦＡＰ×ＬＩＧＨＴ免疫サイトカインのインビボ抗腫瘍活性を明らかにし、処置のタイムライン（図２５Ａ）、腫瘍体積（図２５Ｂ）、生存曲線（図２５Ｃ）及び体重（図２５Ｄ）を示す。 インビボで免疫サイトカインからＬＩＧＨＴ部分を放出する切断を示す、免疫サイトカイン投与時のｈＩｇＧ１に対するＬＩＧＨＴの検出された比を示す。 ＫＰＣモデルにおける抗ＦＡＰ×ＬＩＧＨＴ免疫サイトカインのインビボ抗腫瘍活性を実証する。図２７Ａは、実施例１３の治療タイムラインを概略する。 ＫＰＣモデルにおける抗ＦＡＰ×ＬＩＧＨＴ免疫サイトカインのインビボ抗腫瘍活性を実証する。図２７Ｂは、各群の個々の腫瘍体積を示す。 ＫＰＣモデルにおける抗ＦＡＰ×ＬＩＧＨＴ免疫サイトカインのインビボ抗腫瘍活性を実証する。図２７Ｃは、各群の平均腫瘍体積を示す。 ＫＰＣモデルにおける抗ＦＡＰ×ＬＩＧＨＴ免疫サイトカインのインビボ抗腫瘍活性を実証する。図２７Ｄは、各群の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を示す。 ２９３Ｔ－ＦＡＰ細胞の非存在下又は存在下におけるＨｅＬａ－ＮＦ－κＢ細胞に対する、それぞれＡＢＣ８９０及びＡＢＣ８９２によって誘導されるＮＦ－κＢ活性を示す。 ２９３Ｔ－ＦＡＰ細胞の非存在下又は存在下におけるＨｅＬａ－ＮＦ－κＢ細胞に対する、それぞれＡＢＣ８９０及び