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JP-2026514719-A - 部位特異的ＤＮＡ組換えのための新規のリコンビナーゼ酵素

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Abstract

本発明は、酵素組換え分野のものであり、かつ部位特異的DNA組換えを生じさせる方法であって、a)本質的に同一又は本質的に互いに逆相補的である少なくとも第一及び第二の認識部位を含む核酸を、リコンビナーゼ活性を有するタンパク質と接触させる工程、並びにb)該リコンビナーゼ活性を有するタンパク質に該部位特異的DNA組換えを生じさせる工程を含み、ここで、認識部位が、第一の半部位、スペーサー、及び第二の半部位を含み、かつ本質的に同一又は本質的に互いに逆相補的であることが、該第一の認識部位中の該第一及び該第二の半部位のヌクレオチド配列が該第二の認識部位中の該第一及び該第二の半部位のヌクレオチド配列から最大2ヌクレオチドまで逸脱していてもよいことを意味し、ここで、該リコンビナーゼ活性を有するタンパク質が配列番号1～9のいずれか1つに対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつここで、該少なくとも2つの認識部位が配列番号10～17のいずれか1つによるもしくは配列番号10～17に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体が配列番号10～17に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含む、方法を提供する。 【選択図】なし

Inventors

  • ミリツァ イェリチッチ
  • ルーカス テオ シュミット
  • フランク ブッフホルツ

Assignees

  • テクニスチェ ユニベルシタト ドレスデン ケルパーシャフト デス エーフェントリッヒェン レヒツ

Dates

Publication Date
20260513
Application Date
20240417
Priority Date
20230417

Claims (15)

  1. 部位特異的DNA組換えを生じさせる方法であって、 a)本質的に同一又は本質的に互いに逆相補的である少なくとも第一及び第二の認識部位を含む核酸を、リコンビナーゼ活性を有するタンパク質と接触させる工程、並びに b)該リコンビナーゼ活性を有するタンパク質に該部位特異的DNA組換えを生じさせる工程 :を含み、 ここで、認識部位が、第一の半部位、スペーサー、及び第二の半部位を含み、かつ本質的に同一又は本質的に互いに逆相補的であることが、該第一の認識部位中の該第一及び該第二の半部位のヌクレオチド配列が該第二の認識部位中の該第一及び該第二の半部位のヌクレオチド配列から最大2ヌクレオチドまで逸脱していてもよいことを意味し、ここで、 (i)該リコンビナーゼ活性を有するタンパク質が配列番号7に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、該少なくとも2つの認識部位が配列番号16によるもしくは配列番号16に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体が配列番号16に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含むか;又は (ii)該リコンビナーゼ活性を有するタンパク質が配列番号3に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、該少なくとも2つの認識部位が配列番号12によるもしくは配列番号12に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体が配列番号12に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含むか;又は (iii)該リコンビナーゼ活性を有するタンパク質が配列番号1に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、該少なくとも2つの認識部位が配列番号10によるもしくは配列番号10に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体が配列番号10に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含むか;又は (iv)該リコンビナーゼ活性を有するタンパク質が配列番号2に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、該少なくとも2つの認識部位が配列番号11によるもしくは配列番号11に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体が配列番号11に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含むか;又は (v)該リコンビナーゼ活性を有するタンパク質が配列番号4に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、該少なくとも2つの認識部位が配列番号13によるもしくは配列番号13に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体が配列番号13に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含むか;又は (vi)該リコンビナーゼ活性を有するタンパク質が配列番号5に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、該少なくとも2つの認識部位が配列番号14によるもしくは配列番号14に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体が配列番号14に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含むか;又は (vii)該リコンビナーゼ活性を有するタンパク質が配列番号6に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、該少なくとも2つの認識部位が配列番号15によるもしくは配列番号15に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体が配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含むか;又は (viii)該リコンビナーゼ活性を有するタンパク質が配列番号8に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、該少なくとも2つの認識部位が配列番号17によるもしくは配列番号17に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体が配列番号17に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含むか;又は (ix)該リコンビナーゼ活性を有するタンパク質が配列番号9に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、該少なくとも2つの認識部位が配列番号15によるもしくは配列番号15に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体が配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含む、 前記方法。
  2. 前記リコンビナーゼ活性を有するタンパク質が少なくとも2つのタンパク質単量体を含む、請求項1記載の方法。
  3. 前記組み換えられる核酸配列が細胞内に存在し、好ましくは、 該細胞に前記リコンビナーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸を導入する工程をさらに含むか、又は 該細胞が該リコンビナーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸を含む、 請求項1又は2記載の方法。
  4. 前記リコンビナーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸が調節性核酸配列を含み、かつ該リコンビナーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸の発現が該調節性核酸配列によって調節され、かつ/又は 前記細胞が真核もしくは細菌細胞である、 請求項3記載の方法。
  5. 部位特異的DNA組換えを生じさせるための、配列番号7、配列番号3、配列番号1、配列番号2、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、又は配列番号9に対して少なくとも80％の同一性を有するタンパク質の使用。
  6. 本質的に同一又は本質的に互いに逆相補的である認識部位における部位特異的DNA組換えを触媒するためのリコンビナーゼ活性を有するタンパク質であって、認識部位が、第一の半部位、スペーサー、及び第二の半部位を含み、かつ本質的に同一又は本質的に互いに逆相補的であることが、該第一の認識部位中の該第一及び該第二の半部位のヌクレオチド配列が該第二の認識部位中の該第一及び該第二の半部位のヌクレオチド配列から最大2ヌクレオチドまで逸脱していてもよいことを意味し、ここで: (i)該タンパク質が配列番号7に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、該少なくとも1つの認識部位が配列番号16によるもしくは配列番号16に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体が配列番号16に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含むか;又は (ii)該タンパク質が配列番号3に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、該少なくとも1つの認識部位が配列番号12によるもしくは配列番号12に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体が配列番号12に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含むか;又は (iii)該タンパク質が配列番号1に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、該少なくとも1つの認識部位が配列番号10によるもしくは配列番号10に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体が配列番号10に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含むか;又は (iv)該タンパク質が配列番号2に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、該少なくとも1つの認識部位が配列番号11によるもしくは配列番号11に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体が配列番号11に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含むか;又は (v)該タンパク質が配列番号4に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、該少なくとも1つの認識部位が配列番号13によるもしくは配列番号13に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体が配列番号13に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含むか;又は (vi)該タンパク質が配列番号5に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、該少なくとも1つの認識部位が配列番号14によるもしくは配列番号14に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体が配列番号14に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含むか;又は (vii)該タンパク質が配列番号6に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、該少なくとも1つの認識部位が配列番号15によるもしくは配列番号15に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体が配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含むか;又は (viii)該タンパク質が配列番号8に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、該少なくとも1つの認識部位が配列番号17によるもしくは配列番号17に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体が配列番号17に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含むか;又は (ix)該タンパク質が配列番号9に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、該少なくとも1つの認識部位が配列番号15によるもしくは配列番号15に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体が配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含む、 前記タンパク質の使用。
  7. 多くても40塩基対の長さを有し、かつ (i)配列番号16に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列もしくはそれに逆相補的な核酸配列;又は (ii)配列番号12に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列もしくはそれに逆相補的な核酸配列;又は (iii)配列番号10に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列もしくはそれに逆相補的な核酸配列;又は (iv)配列番号11に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列もしくはそれに逆相補的な核酸配列;又は (v)配列番号13に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列もしくはそれに逆相補的な核酸配列;又は (vi)配列番号14に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列もしくはそれに逆相補的な核酸配列;又は (vii)配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列もしくはそれに逆相補的な核酸配列;又は (viii)配列番号17に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列もしくはそれに逆相補的な核酸配列 :を含む核酸。
  8. 少なくとも1つ、好ましくは、少なくとも2つの請求項7記載の本質的に同一又は本質的に逆相補的な核酸を含むベクターであって、DNAセグメントが、好ましくは、該2つの同一又は逆相補的な核酸に隣接し、該ベクターが、好ましくは、リコンビナーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸をさらに含み、ここで、該リコンビナーゼ活性を有するタンパク質が配列番号1～9のいずれか1つに対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記ベクター。
  9. リコンビナーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸を含むベクターであって、該リコンビナーゼ活性を有するタンパク質が配列番号1～9のいずれか1つに対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記ベクター。
  10. 請求項1～4記載のいずれか一項記載の方法における請求項8又は9のいずれか一項記載のベクターの使用。
  11. 医療において使用するための、好ましくは、対象の遺伝子疾患又は障害を治療する際に使用するための、より好ましくは、該遺伝子疾患又は障害が該対象のゲノムの修飾によって特徴付けられる、配列番号7、配列番号3、配列番号1、配列番号2、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号配列番号8、もしくは配列番号9に対して少なくとも80％の同一性を有するタンパク質、又は請求項8もしくは9記載のベクター。
  12. 以下の組換えDNA断片: (i)少なくとも1つ、好ましくは、少なくとも2つの請求項7記載の核酸;及び/又は (ii)請求項8もしくは9のいずれか一項記載のベクター を含む、単離された宿主細胞。
  13. (i)リコンビナーゼ活性を有するタンパク質をコードし、ここで、該タンパク質が配列番号1～9のいずれか1つに対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、核酸;又は (ii)請求項8もしくは9のいずれか一項記載のベクター :をさらに含む、請求項12記載の単離された宿主細胞。
  14. (i)少なくとも1つ、好ましくは、少なくとも2つの請求項7記載の核酸;又は (ii)請求項8もしくは9のいずれか一項記載のベクター :を含む、非ヒト宿主生物。
  15. 配列番号7、配列番号3、配列番号1、配列番号2、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、又は配列番号9に対して少なくとも80％の同一性を有するタンパク質、請求項7記載の核酸、請求項8もしくは9のいずれか一項記載のベクター、請求項12もしくは13記載の単離された宿主細胞、又は請求項14記載の非ヒト宿主生物、及び任意に、医薬として許容し得る賦形剤を含む、医薬組成物。

Description

本発明は、部位特異的DNA組換えを触媒するためのリコンビナーゼ活性を有するタンパク質の使用、及び部位特異的DNA組換えを生じさせる方法に関する。本発明は、例えば、医学又は医学研究において、単独で又は遺伝子操作用の他のリコンビナーゼシステムと組み合わせて適用可能である。 (発明の背景) 部位特異的リコンビナーゼ(SSR)は、研究、医学、及びバイオテクノロジーにおいて種々の用途を有する、ゲノムの標的化修飾のための信頼できるツールである。SSRは、2つの進化的かつ機構的に異なる酵素ファミリー:チロシンリコンビナーゼ及びセリンリコンビナーゼに分類される(Meinkeらの文献、2016)。それにもかかわらず、SSRは、CRISPR-Cas及び他のヌクレアーゼベースの技術などのDNA改変システムとは異なり、さらなるタンパク質の助けなしで、DNA鎖の切断と即時再結合の両方を触媒することができる(Meinkeらの文献、2016)。ヌクレアーゼベースのアプローチがその有用性を拡大するために集中的に開発されているが(すなわち、塩基エディター及びプライムエディター(Komorらの文献、2016; Gaudelliらの文献、2017; Anzaloneらの文献、2022; Anzaloneらの文献、2019))、これらのシステムは、依然として、DNAニックを通常導入し、細胞固有の修復機構に依存している(Meinkeらの文献、2016)。対照的に、SSRは、自律的に作用することができ、組換えの結果が極めて予測可能である。さらに、ほとんどのSSRは、サイズが比較的小さく、それらを様々な送達ベクターにとってより好都合なものにしている(Meinkeらの文献、2016)。 Cre及びFlpなどのチロシンリコンビナーゼ(Y-SSR)は、異種宿主において効率的なゲノム修飾を行うその簡便性及びその能力のため、ゲノム工学に広く使用される(Sauerらの文献、1988)。したがって、これらのSSRは、これらのタイプの酵素がどのように作用するかをモデル化し、理解するために広く使用された。Cre/loxPシステムは、バクテリオファージP1に由来し、リコンビナーゼCre及び34-bpの標的部位loxPからなる(Sternbergらの文献、1981)。loxP部位は、8-bpのスペーサーによって隔てられた2つの13-bp逆方向反復を有する回文配列である。各々の半部位は、2つのloxP部位上で四量体複合体を形成する1つのリコンビナーゼプロトマーによって結合され、これが一体となってスペーサー領域内での鎖交換を触媒する(Duyne及びHamiltonの文献、1981)。スペーサーの相対的な向きに応じて、Creは、切除、組込み、反転、及び転座などの種々の反応を行うことができる(Meinkeらの文献、2016)。さらに、ゲノム中の2つの異種特異的標的部位とともに提示されると、Creは、単独で、又は他のSSRと組み合わせて、DNA断片の正確な置換のためのリコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)を行うことができる(Meinkeらの文献、2016; Andersonらの文献、2012; Minorikawa及びNakayamaの文献、2011)。 どちらも最も広く使用されているチロシンクラスの部位特異的リコンビナーゼシステムであるCre/loxP及びFlp/FRTシステムに加えて、他のリコンビナーゼシステムが当技術分野で公知である。US 7,422,889号及びUS 7,915,037号は、その認識部位がrox部位と呼ばれる、腸内細菌(Enterobacteria)ファージD6から単離されたDreリコンビナーゼを含む、いわゆる、Dre/roxシステムを開示している。さらに知られているリコンビナーゼシステムは、ビブリオプラスミドp0908から単離されたVCre/VloxPシステム、及びsCre/SloxPシステムである(WO 2010/143606 A1号; Suzuki及びNakayamaの文献、2011)。 さらなる部位特異的DNAリコンビナーゼシステムは、EP 2877585 B1号に開示されているNigri/noxシステム、EP 2690177 B1号に開示されているVika/voxシステム、及びEP 3263708 B1号に開示されているPanto/poxシステムである。 当技術分野で公知であるリコンビナーゼシステムは、異なる起源の細胞で異なる活性を示す。条件付き遺伝子ノックアウトによるトランスジェニック動物の生産などの、多くの応用のために、2つ以上のリコンビナーゼシステムが互いに組み合わせて使用される。しかしながら、新しい複雑な遺伝学研究及び応用は、複数のリコンビナーゼの同時使用を必要とする。同時に、例えば、ゲノム特異性(隠れた認識標的部位に対するオフターゲット活性)のために、十分に説明されている部位特異的リコンビナーゼの全てが全てのモデル生物で等しく適用可能であるわけではない。そのため、標的生物又は実験設定に応じて、最適なリコンビナーゼを選択することができることが重要である。それゆえ、種々の細胞型において、高活性かつ低毒性で、短い標的上での部位特異的DNA組換えを触媒するために使用することができるさらなる特異的リコンビナーゼシステムの提供が当技術分野で必要とされている。 それゆえ、種々の細胞型において使用することができる、部位特異的遺伝子組換えのための新規のリコンビナーゼシステムを提供することが本発明の目的である。本発明の別の目的は、細胞の増殖の阻害が小さい又は本質的にない部位特異的遺伝子組換えのための新規の特異性の高いリコンビナーゼシステムの提供である。 (発明の概要) 本発明の根底にある目的は、部位特異的DNA組換えを生じさせる方法の提供によって解決される。本発明によれば、部位特異的DNA組換えを生じさせる方法は、a)本質的に同一又は本質的に互いに逆相補的である少なくとも第一及び第二の認識部位を含む核酸をリコンビナーゼ活性を有するタンパク質と接触させる工程、並びにb)該リコンビナーゼ活性を有するタンパク質に該部位特異的DNA組換えを生じさせる工程を含む。該方法によれば、認識部位は、第一の半部位、スペーサー、及び第二の半部位を含み、本質的に同一又は本質的に互いに逆相補的であることは、第一の認識部位中の第一及び第二の半部位のヌクレオチド配列が第二の認識部位中の第一及び第二の半部位のヌクレオチド配列から最大2ヌクレオチドまで逸脱していてもよいことを意味する。 本発明の方法の別の態様によれば、リコンビナーゼ活性を有するタンパク質は、配列番号7に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、少なくとも1つの2つの認識部位が、配列番号16によるもしくは配列番号16に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体は、配列番号16に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含む。 本発明の方法の別の態様によれば、リコンビナーゼ活性を有するタンパク質は、配列番号3に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、少なくとも1つの2つの認識部位が、配列番号12によるもしくは配列番号12に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体は、配列番号12に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含む。 本発明の方法の一態様によれば、リコンビナーゼ活性を有するタンパク質は、配列番号1に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、少なくとも1つの2つの認識部位が、配列番号10によるもしくは配列番号10に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体は、配列番号10に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含む。 本発明の方法の別の態様によれば、リコンビナーゼ活性を有するタンパク質は、配列番号2に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、少なくとも1つの2つの認識部位が、配列番号11によるもしくは配列番号11に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体は、配列番号11に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含む。 本発明の方法の別の態様によれば、リコンビナーゼ活性を有するタンパク質は、配列番号4に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、少なくとも1つの2つの認識部位が、配列番号13によるもしくは配列番号13に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体は、配列番号13に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含む。 本発明の方法の別の態様によれば、リコンビナーゼ活性を有するタンパク質は、配列番号5に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、少なくとも1つの2つの認識部位が、配列番号14によるもしくは配列番号14に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体は、配列番号14に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含む。 本発明の方法の別の態様によれば、リコンビナーゼ活性を有するタンパク質は、配列番号6に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、少なくとも1つの2つの認識部位が、配列番号15によるもしくは配列番号15に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体は、配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含む。 本発明の方法の別の態様によれば、リコンビナーゼ活性を有するタンパク質は、配列番号8に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、少なくとも1つの2つの認識部位が、配列番号17によるもしくは配列番号17に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体は、配列番号17に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含む。 本発明の方法の別の態様によれば、リコンビナーゼ活性を有するタンパク質は、配列番号9に対して少なくとも80％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、少なくとも1つの2つの認識部位が、配列番号15によるもしくは配列番号15に逆相補的な核酸配列又はこれらの機能的突然変異体を含み、ここで、該機能的突然変異体は、配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する核酸配列を含む。 一実施態様によれば、リコンビナーゼ活性を有するタンパク質は、少なくとも2つのタンパク質単量体を含む。 一実施態様によれば、組み換えられる核酸配列は、細胞内に存在する。 好ましい実施態様によれば、本方法は、細胞にリコンビナーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸を導入する工程をさらに含む。 別の実施態様によれば、細胞は、リコンビナーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸を含む。 好ましい実施態様によれば、リコンビナーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸は、調節性核酸配列を含み、ここで、リコンビナーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸の発現は、調節性核酸配列によって調節される。 さらなる実施態様によれば、細胞は、真核又は細菌細胞である。 さらなる態様によれば、本発明は、部位特異的DNA組換えを生じさせるための、配列番号7、配列番号3、配列番号1、配列番号2、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号8、又は配列番号9に対して少なくとも80％の同一性を有するタンパク質の使用を提供する。 またさらなる実施態様によれば、本発明は、本質的に同一又は本質的に互いに逆相補的である認識部位での部位特異的DNA組換えを触媒するためのリコンビナーゼ活性を有するタンパク質の使用を提供し、ここで、認識部位は、第一の