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JP-2026514724-A - 新規の自己切断ＤＮＡザイムおよび選択プロセス

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Abstract

本発明は、自己切断活性を有するＤＮＡザイムを選択する新規のインビトロ方法、新規のＤＮＡザイム、および一本鎖ＤＮＡの生成のためのそれらの使用を提供する。

Inventors

  • ヴォロディミル・ミハイリュク
  • ヘンドリック・ディーツ

Assignees

  • テヒニシェ・ウニヴェルジテート・ミュンヘン

Dates

Publication Date
20260513
Application Date
20240419
Priority Date
20230421

Claims (15)

  1. 自己切断活性を有するＤＮＡザイムを選択するための方法であって、前記方法が、 （ａ）複数の一本鎖ＤＮＡ鎖を提供することであって、 各一本鎖ＤＮＡ鎖が、その５’末端の定常領域１およびその３’末端の定常領域２に隣接するランダムなヌクレオチドのコア領域を含み、 各定常領域がプライマー結合部分を含む、提供することと、 （ｂ）前記複数の一本鎖ＤＮＡ鎖を自己切断条件に供することと、 （ｃ）切断産物２を単離し、任意選択で、切断産物１を単離することであって、 前記切断産物２が、前記定常領域２、前記コア領域を含み、 前記切断産物２が、ＤＮＡ自己切断活性を含み、かつ 前記切断産物１が、前記定常領域１を含むか、 または 前記切断産物２が、前記定常領域２、前記コア領域、および定常領域１の一部分を含み、 前記切断産物２が、ＤＮＡ自己切断活性を含み、かつ 前記切断産物１が、前記定常領域１の残りの部分を含む、単離することと、 （ｄ）前記切断産物２の相補体を生成することと、 （ｅ）任意選択で、前記切断産物２の前記相補体を分離することと、 （ｆ）前記切断産物２の前記相補体の３’末端を前記切断産物１の相補体にライゲーションし、それにより、前記ＤＮＡ自己切断活性を有するステップ（ａ）の一本鎖ＤＮＡ鎖の相補体を得ることと、 （ｇ）任意選択で、前記一本鎖ＤＮＡ鎖の前記相補体を分離することと、 （ｈ）前記一本鎖ＤＮＡ鎖の前記相補体を増幅し、それにより、前記ＤＮＡ自己切断活性を含むＤＮＡ鎖を得ることと、 （ｉ）任意選択で、前記自己切断活性を含む前記ＤＮＡ鎖を分離することと、 （ｊ）任意選択で、前記自己切断活性を含む前記ＤＮＡ鎖をエラープローン（ＥＰ－ＰＣＲ）ステップに供することと、 （ｋ）任意選択で、ステップ（ｈ）、任意選択でステップ（ｉ）またはステップ（ｊ）の前記自己切断活性を含む前記ＤＮＡ鎖を、ステップ（ｂ）～（ｈ）の１回以上のラウンドに、かつ任意選択でステップ（ｉ）および／または（ｊ）の１回以上のラウンドに供することと、を含む、方法。
  2. ステップ（ａ）における前記一本鎖ＤＮＡ鎖の前記定常領域１が、前記定常領域２の一部分に相補的な部分を含み、それにより、前記コア領域に隣接するハイブリダイゼーションステムを形成する、請求項１に記載の方法。
  3. ステップ（ａ）における前記一本鎖ＤＮＡ鎖の前記コア領域が、約１４～１００個のヌクレオチド、または約２０～１００個のヌクレオチド、または約２５～５０個のヌクレオチド、または約３０～４０個のヌクレオチド、または約３２～３５個のヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. ステップ（ｂ）における前記自己切断条件が、１つ以上のイオン、好ましくは、一価、二価、および／もしくは三価、ならびに／または多価イオン、例えば、Ｎａ ＋ 、Ｚｎ ２＋ 、Ｍｇ ２＋ 、Ｃｕ ２＋ 、Ｍｎ ２＋ 、Ｃａ ２＋ 、および／もしくはＰＬＬ－ｇ－Ｄｅｘを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. ステップ（ｂ）における前記自己切断条件が、１回目のラウンドで約１５～２０時間、好ましくは約１８時間のインキュベーション時間を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. ステップ（ｃ）における単離が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. ステップ（ｃ）における前記切断産物２が、前記コア領域、前記定常領域２、および自己切断活性を含み、前記切断産物１が、前記定常領域１を含み、前記一本鎖ＤＮＡ鎖の切断が、触媒コアと前記定常領域１との間で生じた、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. ステップ（ｄ）における生成が、好ましくは前記定常領域２の前記プライマー結合部分に結合しているプライマー２を用いた、線形ポリメラーゼ連鎖（ＰＣＲ）増幅を含み、好ましくは、前記プライマー２が切断産物２との区別を可能にするタグを含む、および／または前記プライマー２が標識を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. ステップ（ｈ）における増幅が、ＰＣＲ、好ましくは二段階ＰＣＲを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 請求項１～９のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるＤＮＡザイムであって、好ましくは、前記ＤＮＡザイムが、前記触媒コアと前記定常領域１との間または定常領域１内に自己切断活性を含む、ＤＮＡザイム。
  11. ＤＮＡザイムであって、配列： ５’－ Ｎ ＆ Ｇ Ｙ ＄ Ｙ ＃ ＧＴ Ｎ ＄ Ｙ ＃ ＡＣＧＣ Ｙ ＃ Ｙ ＄ ＹＧＴＣＴＴＡＴＣＧＧＴＴ Ｙ ＄ Ｙ ＄ Ｎ ＃ Ｎ －３’ （配列番号１）を含み、任意選択で、追加のヌクレオチドＮ ＃ が、配列番号１のヌクレオチド２９位と３０位との間に含まれ、ヌクレオチドの番号付けが、配列番号１の５’から３’への方向であり、 配列中、 Ａが、塩基アデニンを有するヌクレオチドであり、 Ｃが、塩基シトシンを有するヌクレオチドであり、 Ｇが、塩基グアニンを有するヌクレオチドであり、 Ｔが、塩基チミジンを有するヌクレオチドであり、 Ｎが、独立して、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴであり、 Ｙが、独立して、ＣまたはＴであり、 ＄ が、独立して、好ましくはＴであり、 ＃ が、独立して、好ましくはＣであり、 ＆ が、独立して、好ましくはＧであり、 前記ＤＮＡザイムが自己切断活性を含む、ＤＮＡザイム。
  12. 前記自己切断活性が、約９２％、約９５％、約９６％、または約９８％の最終収率Ｙ ｍａｘ をもたらし、好ましくは、前記最終収率Ｙ ｍａｘ が、Ｙ＝Ｙ ｍａｘ （１－ｅ －ｋｏｂｓ＊ｔ ））によって計算され、式中、Ｙが反応収率であり、ｋｏｂｓが観測速度定数であり、ｔが反応開始後２４時間以内、好ましくは、反応開始の約２４時間後の時点である、請求項１０または１１に記載のＤＮＡザイム。
  13. 前記自己切断活性が、加水分解切断である、請求項１０～１２のいずれか一項に記載のＤＮＡザイム。
  14. 一本鎖ＤＮＡ分子の生成における、請求項１０～１３のいずれか一項に記載のＤＮＡザイムの使用。
  15. 前記一本鎖ＤＮＡザイムが、ＤＮＡナノテクノロジー、診断、ＤＮＡ合成、または遺伝子療法、好ましくはゲノム編集、より好ましくは相同組換え修復（ＨＤＲ）に使用される、請求項１４に記載の使用。

Description

生体分子および治療用途は、漸進的により洗練された複雑なＤＮＡオリガミの開発の需要を満たしている。ＤＮＡオリガミは、ＤＮＡのプログラム可能性および自己集合特性に依存してナノメートルスケールで設計者によって定義された形状および寸法のナノ構造の製作を可能にする技法である。近年、これは、機能ドメインを含み（Ｇｅｒｌｉｎｇ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，２０１５）、かつより高位の集合体を可能にする（Ｓｉｇｌ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２０２１、Ｐｕｍｍ，ＡＫ．ｅｔ ａｌ．，２０２２）高精度のＤＮＡオリガミ設計への移行の動機になった。 ＥＰ３５１６０５５Ｂ１は、自己切断ＤＮＡ配列を使用した一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のスケーラブルな生物工学的生成のファージ媒介方法について記載している。 ＤＮＡザイムは、化学反応を触媒することができる構造を形成するＤＮＡ分子である（Ｂｒｅａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。自己処理反応を触媒するＤＮＡが存在する（Ｃａｒｍｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。かかるＤＮＡザイムを利用して、特定の反応条件に曝露されたときにそれらの固有の触媒活性に基づいて修飾されるようになるＤＮＡ構築物を作製することができる。例えば、様々な指向性進化戦略を使用して作製された酸化（Ｃａｒｍｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、脱プリン反応（Ｓｈｅｐｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０００）、または加水分解（例えば、Ｃｈａｎｄｒａ ｅｔ ａｌ．，２００９を参照されたい）機構を用いた操作された自己切断ＤＮＡザイムが存在する。 高速かつ高い配列特異性でＤＮＡを加水分解する２つのクラスの操作された自己切断ＤＮＡザイムについて記載されている（Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。Ｉ－Ｒ３と名付けられたかかるＤＮＡザイムの１つは、１つの二本鎖部分構造または２つの二本鎖部分構造のいずれかに隣接する１７個のヌクレオチドからなる小さな触媒コアを有する。このＤＮＡザイムクラスの代表は、ほぼ中性のｐＨでミリモル濃度のＺｎ２＋の存在下でインキュベートされた場合、約１分－１のＤＮＡ加水分解の観測速度定数（ｋｏｂｓ）（約４０秒の半減期）を呈する。このＤＮＡザイムは、３’酸素とＡｐＡ結合のリン中心との間のホスホエステル結合を切断して、５’ホスフェート基を有する３’切断断片を生成する。 ｓｓＤＮＡの生成に使用される場合、Ｉ－Ｒ３ ＤＮＡザイムは、ＤＮＡザイム配列自体に由来する定常末端配列モチーフ（５’では「瘢痕（ｓｃａｒ）」配列ＡＧ、３’ではＡＣＧＴＴＧＡ）を有する標的ｓｓＤＮＡ鎖を生成する。しかしながら、７ｎｔ長の３’モチーフの相補的配列を収容しようとする試みは、ＤＮＡオリガミ足場鎖に複数の長い反復配列を導入するであろう。これにより、構造集合反応中のＤＮＡの対処可能性（ａｄｄｒｅｓｓａｂｉｌｉｔｙ）が損なわれる場合があり、結果として、構造がほとんどまたは全く生成されない、かつ／あるいは誤って折り畳まれた構造が形成され得る。あるいは、切断点にｓｓＤＮＡオーバーハングを残すことは、より高次の集合体に対して平滑末端スタッキング相互作用を使用した機能ドメインとは不適合であろう。更に、相同組換え修復（ＨＤＲ）用途は、非相同ｓｓＤＮＡオーバーハングの悪影響を受け得る。 Ｑｉａｏ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０２２は、部位特異的ＤＮＡ切断の完全な一般性を示す一方で、オーバーハングモチーフも除去するＩＩ－Ｒ２／３ ＤＮＡザイムについて記載している。しかしながら、ＩＲ３のコア（４０ｎｔ）と比較してＩＩ－Ｒ２／３の顕著により大きいコア（５９ｎｔ）は、ＩＩ－Ｒ２／３に見られるような不十分な切断収率（およそ９０％でキャップされる）とともに、ＤＮＡオリガミに必要な複数（３０個超）の任意のｓｓＤＮＡの大量生産を成功させるためのＩＩ－Ｒ２／３の有用性を著しく損なう。 ＤＮＡザイムについての報告されているインビトロ選択戦略の大半は、３つの主要な群に割り当てることができる。第１の群は、触媒コアからある距離にある定常配列内で切断を行うように設計された全く初めて発見されたＤＮＡおよびＲＮＡ自己切断ＤＮＡザイムを網羅する（Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｒ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，１９９４、Ｃａｒｍｉ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，１９９６）。第２の群は、ＤＮＡザイムコアを基質の所定の領域に向ける結合アームとして２つの定常隣接配列を用いる（Ｃｈａｎｄｒａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｌｅｅ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．；２０１７）。ＤＮＡライブラリの環状化に基づくインビトロ選択方法（Ｇｕ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｚｈａｎｇ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２０２１）が第３の群を構成する。進化する触媒コア内の切断部位の選択の自由度を利用して、このアプローチは、最も活性なＤＮＡ切断ＤＮＡザイムのうちの１つをもたらした。 報告されている方法が豊富であるにもかかわらず、ランダムな空間から瘢痕のない自己切断ＤＮＡザイムを意図的に生成することを可能にするものはない。利用可能なアプローチは、所望の切断部位を有する既存のＤＮＡザイムに依存する（Ｑｉａｏ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０２２）か、または既知の基質配列内の切断部位に選択圧力を与える（Ｘｉａｏ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，２０１２）かのいずれかである。 自己切断ＤＮＡザイムのための新規のインビトロ選択プロセスの一般的なスキームを示す。インビトロ選択手順は、４つの主要なステップ：切断反応（Ｉ）、活性画分の逆相補体の生成（ＩＩ）、ライゲーションによる５’定常配列の修復（ＩＩＩ）、ＰＣＲ増幅（ＩＶ）に分けることができる。切断部位は、５’定常配列とコア（後者はハサミのシンボルで示されている）との間の切断を含む５’定常配列内で選択することができる。ライゲーションアダプター配列は、適宜設計されなければならない。堅牢な切断剤（ｃｌｅａｖｅｒ）をその作用様式にかかわらず得るために、意図された部位でＤＮＡ切断をもたらす限り、任意の触媒タイプの切断を可能にする戦略を実施した。したがって、濃縮プールを直接用いて作業を始める代わりに、配列データを逆相補体の形態で新たなＤＮＡ鎖に転送した。５’末端の定常領域１の第１のヌクレオチド（薄灰色）の切断に進化的圧力を加える自己切断ＤＮＡザイムのための新規のインビトロ区分プロセスの特定の実施形態を示す。初期ＤＮＡザイムライブラリ配列をかなり従来の方法で構築し、ランダム化コア領域（黒色）は２つの定常領域１および２（灰色）に隣接した。後者は互いに部分的に相補的であり、コアループのための末端ハイブリダイゼーションステムを形成し、それ故に、ＤＮＡザイムカセット設定を模倣した。非ハイブリダイゼーション部分は、増幅ステップのためのプライマー結合領域として機能した。初期ライブラリは、４つのサブライブラリからなった。それらは各々、選択開始時に１つの固定されたヌクレオチドに対するバイアスを避けることを意図して事前に選択された切断部位において４つの可能な塩基対のうちの１つを特徴とした。既に利用可能なＩ－Ｒ３およびＩＩ－Ｒ２／３よりもコンパクトなＤＮＡザイムを生成することを目指して、我々はＮ３２コア領域に決めた。親ＤＮＡザイム１２－１１およびその再選択された変異体の活性を示す。Ａ．インキュベーションの２４時間後に切断された画分、Ｂ．経時的な切断反応の進行、Ｃ．擬一次速度モデルに適合された切断収率対時間データ。切断部位における４つのヌクレオチドのうちの１つの状況下で自己切断反応を行う１２－１１ ＤＮＡザイムおよび選択された変異体についての試験した自己切断ＤＮＡザイムおよび活性データの配列を示す。ＤＭＳアッセイおよび質量分析による１２－１１ ＤＮＡザイムの切断部位の確認。Ａ：１２－１１ ＤＮＡザイムの二重標識オリゴヌクレオチドの配列、触媒コアには下線が引かれており、切断部位には印が付けられている、Ｂ：１５％ＰＡＧＥで分解され、かつＣｙ３およびＣｙ５末端タグの励起によって画像化された二重標識１２－１１ ＤＮＡザイムおよびその切断産物（１および２）の割り当てられたＤＭＳラダー、Ｃ：ＥＳＩ－ＭＳによって検出された１２－１１切断による産物。 別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。 本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、「を含むが、これらに限定されない」を意味する。この用語は、任意の記載された特徴、要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）、要素（ｉｎｔｅｇｅｒ）、ステップ、または構成要素の存在を特定するためにオープンエンドであるよう意図されているが、１つ以上の他の特徴、要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）、要素（ｉｎｔｅｇｅｒ）、ステップ、構成要素、またはそれらの群の存在または追加を除外するようには意図されていない。したがって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、「からなる」および「から本質的になる」というより限定的な用語を含む。一実施形態では、本出願を通して、特に特許請求の範囲内で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、「からなる」または「から本質的になる」という用語によって置き換えられてもよい。 本発明を説明する文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語、ならびに同様の指示対象は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を包含すると解釈されるべきである。例えば、「定常領域」という用語には、複数の定常領域（その混合物を含む）が含まれる。複数形が化合物および塩などに使用される場合、これは単一の化合物または塩なども意味すると解釈される。 本開示の文脈において、「ＤＮＡ」という用語は、ヌクレオチドと呼ばれる単量体単位の一本鎖で構成されているデオキシリボ核酸を指し、各ヌクレオチドは、窒素含有核酸塩基、２－デオキシリボース糖部分、およびホスフェート基で構成されており、個々のヌクレオチドは、２－デオキシリボース糖部分の５’位のＯＨ基を隣接する２－デオキシリボース糖部分の３’位のＯＨ基に連結するホスフェート基によって一本鎖で連結されている。特定の実施形態では、窒素含有核酸塩基は、独立して、シトシン［Ｃ］、グアニン［Ｇ］、アデニン［Ａ］、およびチミン［Ｔ］から選択される。特定の実施形態では、これらの核酸塩基のうちの１つ以上は非標準塩基、特に、修飾アデノシン、特にＮ６－カルバモイル－メチルアデニンもしくはＮ６－メチヤデニン；修飾グアニン、特に７－デアザグアニンもしくは７－メチルグアニン；修飾シトシン、Ｎ４－メチルシトシン、５－カルボキシルシトシン、５－ホルミルシトシン、５－グリコシルヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシシトシン、もしくは５－メチルシトシン；修飾チミジン、特にａ－グルタミルチミジンもしくはａ－プトレシニルチミン；ウラシルもしくはその修飾、特にウラシル、塩基Ｊ、５－ジヒドロキシペンタウラシル；または５－ヒドロキシメチルデオキシウラシル；デオキシアーケオシン；および２，６－ジアミノプリンのリストから選択される非標準塩基である。ＤＮＡの一本鎖のひと続きまたは一部分は、二本鎖を形成するために相補的な核酸塩基の相互作用によってＤＮＡの相補的なひと続きと相互作用し得、シトシンとグアニンおよびアデニンとチミンは、それぞれ、核酸塩基間に２つ（Ａ／Ｔ）および３つ（Ｇ／Ｃ）の水素結合を形成することによって、互いに相補的である。二本鎖は、ゲノムＤＮＡの場合のように、互いに完全に相補的なＤＮＡの２つの一本鎖によって、またはＤＮＡの１つの一本鎖が２つ以上の他の一本鎖ＤＮＡ鎖