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JP-2026514742-A - トランスポゾン、ベクター及び遺伝子改変細胞

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Abstract

遍在的クロマチン開放エレメント（ＵＣＯＥ）核酸配列、及び目的の遺伝子又はその断片の核酸配列、及び任意選択的に３’ポリアデニル化配列をプロモーターの制御下で含み、Piggybac（商標）トランスポゾンに特異的な逆位末端リピート配列ＰＢ５’ＩＴＲ及びＰＢ３’ＩＴＲによって隣接される、トランスポゾンに関する。 【選択図】図１

Inventors

  • カッセッタ，ルカ
  • ロペス－イリゴージェン，マルタ
  • ウィッチャー，クリシュトフ ビー．

Assignees

  • マコミクス リミテッド

Dates

Publication Date
20260513
Application Date
20240417
Priority Date
20230417

Claims (20)

  1. 遍在的クロマチン開放エレメント（ＵＣＯＥ）核酸配列、及び目的の遺伝子又はその断片の核酸配列、及び任意選択的に３’ポリアデニル化配列をプロモーターの制御下で含み、Piggybac（商標）トランスポゾンに特異的な逆位末端リピート配列ＰＢ５’ＩＴＲ及びＰＢ３’ＩＴＲによって隣接される、トランスポゾン。
  2. 前記ＵＣＯＥが、ＣＢＸ３に先行するＣＢＸ３－ＵＣＯＥ核酸配列である、請求項１に記載のトランスポゾン。
  3. 前記ＵＣＯＥが、配列番号１の核酸配列である、請求項１又は請求項２に記載のトランスポゾン。
  4. 前記Piggybac（商標）トランスポゾンに特異的な逆位末端リピート配列が、ＰＢ５’ＩＴＲ（配列番号２）及びＰＢ３’ＩＴＲ（配列番号３）である、請求項１に記載のトランスポゾン。
  5. 前記プロモーター、目的の遺伝子又はその断片、及び任意選択的に３’ポリアデニル化配列が、発現カセット内に含まれる、請求項１～４のいずれか一項に記載のトランスポゾン。
  6. 発現カセットが、 （ａ）プロモーター、 （ｂ）前記プロモーターの下流の少なくとも１つのクローニング部位（制限酵素切断部位）又は多重クローニング部位、 （ｃ）前記プロモーターの下流の、それに作動可能に連結されている目的の遺伝子、 （ｄ）目的の前記遺伝子の下流に位置し、それに作動可能に連結されているポリアデニル化配列、 （ｅ）任意選択的に、内部リボソーム進入部位、 （ｆ）任意選択的に、目的の前記遺伝子及びポリアデニル化配列の下流に位置する第２のプロモーター配列、 （ｇ）任意選択的に、前記第２のプロモーターの下流に位置する蛍光タンパク質配列、 （ｈ）自己切断ペプチド配列、 （ｉ）任意選択的に、選択、例えば抗生物質選択のための遺伝子、 （ｊ）任意選択的に、蛍光タンパク質遺伝子、及び （ｋ）任意選択的に、第２のポリアデニル化配列 を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のトランスポゾン。
  7. 前記発現カセットが、 （ａ）ＣＭＶプロモーター、 （ｂ）前記プロモーターの下流の多重クローニング部位、 （ｃ）前記プロモーターの下流の、それに作動可能に連結されている目的の遺伝子であって、任意選択的に配列番号４のヒトＳＩＧＬＥＣ１０遺伝子である目的の遺伝子、 （ｄ）目的の前記遺伝子の下流に位置し、それに作動可能に連結されているウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨポリ（Ａ）シグナル）（配列番号５）、 （ｅ）任意選択的に、内部リボソーム進入部位、 （ｆ）目的の前記遺伝子及びポリアデニル化配列の下流に位置するＥＦ１α（ショートバージョン）（配列番号６）配列、及び （ｇ）前記第２のプロモーターの下流に位置する蛍光タンパク質（ＣｏｐＧＦＰ（配列番号７））配列、 （ｈ）前記蛍光タンパク質配列の下流に位置するＴ２Ａ自己切断ペプチド配列（配列番号８）、 （ｉ）ピューロマイシン耐性遺伝子、並びに （ｊ）ＳＶ４０ポリ（Ａ）：サルウイルス４０ポリアデニル化配列 を含む、請求項６に記載のトランスポゾン。
  8. 前記発現カセットが、 （ａ）ＣＡＧプロモーター、 （ｂ）前記プロモーターの下流の多重クローニング部位、 （ｃ）前記プロモーターの下流の、それに作動可能に連結されている目的の遺伝子であって、任意選択的に、配列番号９のｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ配列（死滅／非活性化Ｃａｓ９と前記抑制ドメイン及び核局在化シグナル配列）である目的の遺伝子、 （ｄ）目的の前記遺伝子、例えば配列番号９のｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ配列の下流に位置するＴ２Ａ自己切断ペプチド配列（配列番号８）、及び （ｅ）前記Ｔ２Ａ自己切断ペプチド配列（配列番号８）の下流に位置する、ｅＧＦＰ（強化された緑色蛍光タンパク質）をコードする蛍光タンパク質遺伝子配列、 （ｆ）ｒＢＧポリアデニル化配列 を含む、請求項６に記載のトランスポゾン。
  9. 前記発現カセットが、 （ａ）ＣＡＧプロモーター、 （ｂ）前記プロモーターの下流の多重クローニング部位、 （ｃ）前記プロモーターの下流の、それに作動可能に連結されている目的の遺伝子であって、任意選択的に、配列番号１０のｄＣａｓ９－ＶＰＲ配列である目的の遺伝子、 （ｄ）目的の前記遺伝子、例えば配列番号１０のｄＣａｓ９－ＶＰＲ配列の下流に位置するＴ２Ａ自己切断ペプチド配列、並びに （ｅ）前記Ｔ２Ａ自己切断ペプチド配列（配列番号８）の下流に位置する、ｅＧＦＰ（強化された緑色蛍光タンパク質）をコードする蛍光タンパク質遺伝子配列、 （ｆ）ｒＢＧポリアデニル化配列 を含む、請求項６に記載のトランスポゾン。
  10. 好ましくは、PiggyBac（登録商標）ベクター、例えば、配列番号１１、配列番号１３、又は配列番号１４のプラスミドベクターである、請求項１～９のいずれか一項に記載のトランスポゾンを含むベクター。
  11. 任意選択的に、トランスポザーゼであって、好ましくはPiggyBac（商標）トランスポザーゼであるトランスポザーゼを発現する能力がある第２のベクター（例えば、配列番号２４のSuper PiggyBac（商標）トランスポザーゼプラスミドベクター）を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のトランスポゾン及び／又はベクターを含む細胞。
  12. 請求項１～１１のいずれか一項に記載のトランスポゾン（発現構築物／トランス遺伝子）であって、前記細胞ゲノムに組み込まれるトランスポゾンを含む細胞。
  13. 未分化細胞、部分分化細胞及び完全分化細胞から選択され、任意選択的に、分化状態はフローサイトメトリーマーカーのパネルを使用することによって評価される、請求項１１又は請求項１２に記載の細胞。
  14. 人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem)（ｉＰＳＣ）、部分的に又は完全に分化したｉＰＳＣ由来マクロファージ、ｉＰＳ由来の好中球、ＮＫ、単球、筋細胞、肝細胞、ニューロン及び前駆細胞から選択される、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の細胞。
  15. （ａ）目的の遺伝子（トランス遺伝子）のサイレンシングを防止する （ｂ）目的の遺伝子の発現を促進する、 （ｃ）目的の遺伝子の産物を発現する、及び／又は （ｄ）より大きい（≧７．０Ｋｂ）発現カセットを発現する ための方法であって、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の細胞を培養することを含む方法。
  16. （ａ）目的の遺伝子（トランス遺伝子）のサイレンシングを防止する、及び／又は （ｂ）分化の間、目的の遺伝子の発現を維持する ための方法であって、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の細胞を分化刺激の存在下で培養することを含む方法。
  17. 標的遺伝子の発現のノックダウン（下方制御）のための方法であって、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢを含む請求項１１～１４のいずれか一項に記載の細胞を（例えば、レンチウイルスベクターを介して送達される）前記標的遺伝子指向性ｇＲＮＡの存在下で培養することを含む方法。
  18. 標的遺伝子の発現を誘導又は上方制御するための方法であって、ｄＣａｓ９－ＶＰＲを含む請求項１１～１４のいずれか一項に記載の細胞を（例えば、レンチウイルスベクターを介して送達される）前記標的遺伝子指向性ｇＲＮＡの存在下で培養することを含む方法。
  19. 請求項１～１４のいずれか一項に記載のトランスポゾン、ベクター及び／又は細胞及び担体を含む組成物。
  20. 請求項１～１４のいずれか一項に記載のトランスポゾン、ベクター及び／又は細胞及びトランスポザーゼを発現する能力があるベクターを含む組成物。

Description

技術分野 本発明は、遍在的クロマチン開放エレメント（ＵＣＯＥ）核酸配列、及び目的の遺伝子をコードする核酸配列をプロモーターの制御下で含み、Piggybac（商標）トランスポゾンに特異的な逆位末端リピート配列ＰＢ５’ＩＴＲ及びＰＢ３’ＩＴＲによって隣接される、トランスポゾン、かかるトランスポゾンを含むベクター、かかるトランスポゾン又はベクターを含む細胞、及びかかるトランスポゾンが組み込まれている細胞、並びにかかるトランスポゾン又はベクターを含むｉＰＳＣ細胞の遺伝子操作及びマクロファージなどの部分成熟細胞又は完全成熟細胞への分化のための方法、並びにかかる細胞の使用に関する。 発明の背景 米国特許出願公開第２０２００１５７５６７Ａ１号には、トランスポゾン及びトランスポザーゼをコードする核酸を含むウイルスベクターについての記載がある。トランスポゾンは、標的細胞のゲノムに組み込むための、トランス遺伝子、又はトランス遺伝子のための挿入部位を含む。トランスポザーゼの発現は、ウイルスベクターの産生又はパッケージングの間にトランスポザーゼが発現されないように制御される。さらに、トランスポゾンは、ウイルスゲノムのためのパッケージングシグナルを含むことで、トランスポゾンが除去されている任意のウイルスゲノムのパッケージングが阻止される。また、修飾された哺乳動物細胞を産生するためのプロセス、及び本発明のウイルスベクターを用いて、修飾ゲノムを有する哺乳動物細胞を産生するためのプロセスが開示される。 米国特許出願公開第２０２２００３３８４５Ａ１号には、哺乳動物細胞において組換えタンパク質（例えば、生物製剤）を発現させるための発現ベクター、発現ベクターを含む宿主細胞、組換えタンパク質を産生する方法、及び発現ベクターを増殖させる方法についての記載がある。 豪州特許出願公開第２０１９２５０２２４Ｂ２号には、特に、発現産物の発現及び細胞からの輸送の高い安定性を含む、発現の量及び質についての利点を示す非霊長類真核宿主細胞における、目的のＤＮＡを発現するための構築物及び方法についての記載がある。 国際公開第２０２２１０４１５５Ａ１号には、異種移植片の生存及び／又は耐容性の増強のための１つ以上の修飾遺伝子を有する細胞、組織、臓器、及び／又は動物についての記載がある。また、修飾遺伝子の１つ以上を有する細胞、組織、臓器、及び／又は動物を作製し、使用する方法が開示されている。 欧州特許第２４１７２６３Ｂ１号には、ベクター骨格、プロモーター、及び目的のタンパク質をコードする目的の遺伝子などのベクターの構成要素、並びにこれらの構成要素を含むトランスポゾンベースのベクターを含む、特定のタンパク質のインビトロ又はインビボ産生のための組成物についての記載がある。また、これらの組成物を作製する方法、及び所望のタンパク質をインビボで又はトランスフェクト細胞内でインビトロで産生するためにこれらの組成物を使用する方法が記載されている。 韓国特許出願公開第２０２１０１４３８９７Ａ号には、マトリックス付着領域（ＭＡＲｓ）、ＭＡＲを含む組換えベクター、組換えベクターで形質転換される形質転換体、及び形質転換体を培養して標的タンパク質を産生する方法についての記載がある。 国際公開第２０２０１６４７０２Ａ１号には、トランスポザーゼ及び少なくとも１つの異種クロマチンリーダーエレメント（ＣＲＥ）を含むポリペプチド、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びそのポリヌクレオチドを含むベクターについての記載がある。そのポリヌクレオチドを含む人工転位因子は、異種クロマチンリーダーエレメントと共役したトランスポザーゼを介して活性クロマチンを標的化することができる。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5473066/pdf/tmh-0044-0135.pdf Ackermann,M.et al.(2017)では、遺伝子組換えｉＰＳＣ株を使用し、発現カセットのヒトＡＡＶＳ１セーフハーバーへのＣＢＸ３－ＵＣＯＥ又はＺＦＮ媒介性標的化を備えたレンチウイルスベクターを使用して、マクロファージへの造血分化中のトランス遺伝子の安定性に対処することで、ｉＰＳＣｓ及び分化マクロファージにおける安定なトランス遺伝子発現のためのツールが提供された。無作為に組み込まれたレンチウイルスベクター発現系又はセーフハーバーＡＡＶＳ１のいずれかからレポーター遺伝子を発現する異なるｉＰＳＣ株を使用することにより、多能性細胞及びそれから誘導されたマクロファージにおけるレポーター遺伝子の発現が可能になり、ｉＰＳＣｓにおいて治療的トランス遺伝子を効率的に発現するそれらの適合性が示された。 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4330381/ Mueller-Kuller,U.et al.(2015)では、機能的な０．７ｋｂの最小のＣＢＸ３－ＵＣＯＥ及び構成的又は組織特異的なプロモーターを導入して、複能性幹細胞及び多能性幹細胞におけるトランス遺伝子発現のエピジェネティックサイレンシングに対抗した。プロモーターサイレンシングを阻止することに加えて、ＣＢＸ３－ＵＣＯＥエレメントのクロマチン開放機能は、隣接する異種ＤＮＡ領域に伝播することができた。ＣＢＸ３－ＵＣＯＥのこの特徴は、組み込まれたＣＢＸ３－ＵＣＯＥを含有するベクターがクロマチン状態、ひいては組み込み部位の近傍に位置する細胞遺伝子の発現パターンを改変し得ることから、潜在的に関心があった。内因性ＣＢＸ３遺伝子のクロマチン開放機能は、非メチル化ＤＮＡからメチル化ＤＮＡへの移行及び活性ヒストンマークの存在によって定義されるとおり、プロモーター領域の中央に置かれ、約１．５ｋｂのＤＮＡ領域に及ぶように思われた。使用されるレンチウイルスベクター内で、ＣＢＸ３－ＵＣＯＥの５’－ＬＴＲの左側境界に対する距離は１．７ｋｂであったことから、理論上、細胞配列のＣＢＸ３－ＵＣＯＥに対する最小距離は、エレメントのクロマチン開放効果によって網羅される距離を上回った。 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31706316/Skipper KA et al.(2019)では、sleeping beautyトランスポゾンベクター内のＨＮＲＰＡ２Ｂ１－ＣＢＸ３ ＵＣＯＥのコア断片を使用してＣＨＯ細胞が修飾され、ＣＨＯ－Ｋ１細胞における４つの異なる保護的方法が比較され、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１－ＣＢＸ３遺伝子座から誘導された遍在的クロマチン開放エレメント（ＵＣＯＥ）によって媒介される、トランス遺伝子カセットのサイレンシングからの強固な保護が見出された。バイオインフォマティクス手法を用いて、より短いＨＮＲＰＡ２Ｂ１－ＣＢＸ３ ＵＣＯＥコア断片が定義され、より短いＨＮＲＰＡ２Ｂ１－ＣＢＸ３ ＵＣＯＥコア断片を備えたＤＮＡトランスポゾンベクターを有するＣＨＯ－Ｋ１細胞の拡張継代後にトランス遺伝子発現を維持することが実証された。 図面の一覧 Ａ．ＰＢ－ＵＣＯＥ－ＳＩＧＬＥＣ１０プラスミド（配列番号１１）のマップ。ＰＢ：PiggyBac、ＩＴＲ：逆方向タンデムリピート、ＵＣＯＥ：遍在的クロマチン開放エレメント、ＣＭＶ：サイトメガロウイルス、ｈＳＩＧＬＥＣ１０：ヒトシアル酸結合Ｉｇ様レクチン１０のコドン最適化配列、ｂｇＨポリ（Ａ）：ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ＥＦ１α：伸長因子１α、ＣｏｐＧＦＰ：カイアシ類(Pontellina plumate)緑色蛍光タンパク質、Ｔ２Ａ：２Ａ自己切断ペプチド、ＰｕｒｏＲ：ピューロマイシン耐性、ＳＶ４０ポリ（Ａ）：サルウイルス４０ポリアデニル化配列。 Ａ．非トランスフェクトＳＦＣｉ５５野生型ｉＰＳ細胞及びＰＢ－ＵＣＯＥ－ＳＩＧＬＥＣ１０＋Super PiggyBacトランスポザーゼがトランスフェクトされたＳＦＣｉ５５－ｉＰＳＣ細胞についてのＣｏｐＧＦＰ発現の代表的なフローサイトメトリーヒストグラム。Ｂ．非トランスフェクトＳＦＣｉ５５－ｉＰＳ細胞及びＰＢ－ＣＢＸ３－ＳＩＧＬＥＣ１０＋Super PiggyBacトランスポザーゼがトランスフェクトされたＳＦＣｉ５５－ｉＰＳＣ細胞についてのＳＩＧＬＥＣ１０タンパク質発現の代表的なフローサイトメトリーヒストグラム。Ｃ．非トランスフェクトＳＦＣｉ５５－ｉＰＳ細胞から誘導されたｉＰＳＣ由来マクロファージ及びＰＢ－ＣＢＸ３－ＳＩＧＬＥＣ１０＋Super PiggyBacトランスポザーゼがトランスフェクトされたＳＦＣｉ５５－ｉＰＳＣ細胞から誘導されたマクロファージについてのＣｏｐＧＦＰ発現の代表的なフローサイトメトリーヒストグラム。Ｄ．非トランスフェクトＳＦＣｉ５５－ｉＰＳ細胞から誘導されたｉＰＳＣ由来マクロファージ（左）及びＰＢ－ＣＢＸ３－ＳＩＧＬＥＣ１０＋Super PiggyBacトランスポザーゼがトランスフェクトされたＳＦＣｉ５５－ｉＰＳＣ細胞から誘導されたマクロファージについてのＳＩＧＬＥＣ１０タンパク質発現の代表的なフローサイトメトリーヒストグラム。 Ａ．親株ＳＦＣｉ５５ ＷＴ（野生型）及び３つのＰＢ－ＵＣＯＥ－ＳＩＧＬＥＣ１０改変クローン株、即ち、ＳＩＧＬＥＣ１０ １．３、ＳＩＧＬＥＣ１０ ２．１９、ＳＩＧＬＥＣ１０ ２．３９からのｉＰＳＣ細胞（幹細胞段階）についてのＳＩＧＬＥＣ１０発現の代表的なフローサイトメトリーヒストグラム。ＳＩＧＬＥＣ１０ ＯＥは、ＳＩＧＬＥＣ１０の過剰発現を表す。 Ｂ．親株ＳＦＣｉ５５野生型株及び３つの改変クローン株（ＳＩＧＬＥＣ１０ １．３、ＳＩＧＬＥＣ１０ ２．１９、ＳＩＧＬＥＣ１０ ２．３９）からの細胞（マクロファージ段階）についてのＳＩＧＬＥＣ１０発現の代表的なフローサイトメトリーヒストグラム。 Ｃ．ＳＦＣｉ５５親株及び３つの改変されたクローン株（ＳＩＧＬＥＣ１０ １．３、ＳＩＧＬＥＣ１０ ２．１９、ＳＩＧＬＥＣ１０ ２．３９）ｎ＝３から誘導されたマクロファージについてのデルタＭＦＩ（ＳＩＧＬＥＣ１０抗体で染色されたサンプルの中央値蛍光強度－ＩｇＧ１アイソタイプ染色サンプルの中央値蛍光強度）の編集。 ＳＦＣｉ５５親野生型株の、３つの異なるＳＩＧＬＥＣ１０を過剰発現する（ＳＩＧＬＥＣ１０ ＯＥ）ｉＰＳＣクローン株：１．３、２．１９及び２．３９と比較した、ＣＤ４５、ＣＤ９３、２５Ｆ９、ＣＤ１４、ＣＤ１６３、及びＣＤ１６９マーカーについての発現プロファイル。３つの独立的に実施されたレプリカからの１つの実験を代表するフローサイトメトリーヒストグラム。 親株からのマクロファージ、及び（クローン株ＳＩＧＬＥＣ１０ ＯＥの１．３、２．１９及び２．３９からの）ＳＩＧＬＥＣ１０を過剰発現するマクロファージの食作用レベル。食作用は、２０分間隔で５時間測定されたレッド蛍光の曲線下面積（ＡＵＣ）として定量化される。ＣＤ２４を発現する改変されたジャーカット細胞が、pHrodoレッド標識色素で標識され、３つのジャーカット細胞でのベイトとして示された：１のマクロファージ比。（ｎ＝６の生物学的に独立したサンプル）ダンの事後検定を伴うクラスカル・ウォリス検定）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 Ａ．ＰＢ－ＵＣＯＥ－ｄＣａｓ９ＫＲＡＢ－ｅＧＦＰプラスミドマップ。ＰＢ：PiggyBac、ＩＴＲ：逆方向タンデムリピート、ＵＣＯＥ：遍在的クロマチン開放エレメント、ＣＡＧプロモーター：ニワトリβアクチンプロモーターサイトメガロウイルスに融合されたサイ