JP-2026514767-A - 血友病の治療のための操作された細胞調製物

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Abstract

本開示は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）を産生する操作されたＢ系列細胞集団を培養、操作、及び投与するための方法ならびに組成物を提供する。本開示は、とりわけ、改変された免疫細胞（例えば、Ｂ系列細胞）を含む組成物及び方法を包含する。本開示は、とりわけ、本明細書に記載の第ＩＸ因子（ＦＩＸ）をコードする１つ以上の核酸配列を含む核酸構築物、及びそれを産生する方法も包含する。本開示は、とりわけ、ＦＩＸを発現する操作されたＢ系列細胞集団を提供する。【選択図】図１

Inventors

ミュレン，ティモシージェイムズ
リウ，ハンラン
ホーマン，アーニャフィデス
アルラウカス，ショーンフィリップリアリー
シン，スワティ
キーガン，ショーンパトリック
モーガン，リチャードエー．

Assignees

ビーバイオファーマ，インコーポレイテッド

Dates

Publication Date: 20260513
Application Date: 20240416
Priority Date: 20230417

Claims (20)

第ＩＸ因子（ＦＩＸ）を発現する操作されたＢ系列細胞集団を調製する方法であって、前記方法が、（ａ）一次Ｂ細胞集団が得られるように一次Ｂ細胞を単離するステップと、（ｂ）前記一次Ｂ細胞集団を活性化するステップと、（ｃ）前記活性化ステップ中または後に、ＣＣＲ５部位、ＩｇＨ部位、及びＪＣＨＡＩＮ部位から選択される部位にＦＩＸをコードする導入遺伝子を組み込むことによって、前記一次Ｂ細胞集団を操作し、それによって、操作されたＢ系列細胞集団を生成するステップと、を含む、前記方法。
前記操作されたＢ系列細胞集団を拡大するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
前記操作されたＢ系列細胞集団を形質芽細胞の集団へと分化させるステップを更に含む、請求項１または２に記載の方法。
前記分化ステップが、前記操作されたＢ系列細胞集団を、（ａ）ＩＬ－２、（ｂ）ＩＬ－６、（ｃ）ＩＬ－１０、及び／または（ｄ）ＩＬ－１５を含む培養培地と接触させることを含む、請求項３に記載の方法。
前記形質芽細胞の集団を形質細胞の集団へと分化させるステップを更に含む、請求項３または４に記載の方法。
前記分化ステップが、前記形質芽細胞の集団を、（ａ）ＩＬ－６、（ｂ）ＩＬ－１５、及び／または（ｃ）ＩＦＮ－アルファ－２－ベータ（ＩＦＮα－２β）を含む培養培地と接触させることを含む、請求項５に記載の方法。
前記操作されたＢ系列細胞集団を、ヒト血清またはウシ血清を含まない細胞培養培地に約２４時間移植するステップを更に含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
前記操作のステップが、前記導入遺伝子を含むドナー構築物を前記一次Ｂ細胞集団に導入することを更に含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
前記ドナー構築物が、（ａ）二本鎖切断部位に対して５’側の配列に対して少なくとも９５％同一である５’相同性アームと、（ｂ）前記二本鎖切断部位に対して３’側の配列に対して少なくとも９５％同一である３’相同性アームと、を含む、請求項８に記載の方法。
前記５’相同性アームが、（ｉ）約４５０～８５０塩基対の長さのサイズ、（ｉｉ）ＰＡＭ部位もしくはＰＡＭ部位の不在、及び／または（ｉｉｉ）前記３’相同性アームと対称もしくは非対称の長さを含むか、あるいはそれらである、請求項９に記載の方法。
前記３’相同性アームが、（ｉ）約４５０～８５０塩基対の長さのサイズ、（ｉｉ）ＰＡＭ部位もしくはＰＡＭ部位の不在、及び／または（ｉｉｉ）前記５’相同性アームと対称もしくは非対称の長さを含むか、あるいはそれらである、請求項９または１０に記載の方法。
前記５’相同性アームが、配列番号１０～１３のうちの１つ以上と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項９に記載の方法。
前記３’相同性アームが、配列番号１４～１８のうちの１つ以上と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項９に記載の方法。
前記ドナー構築物が、配列番号１９～２１のうちの１つ以上と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項８に記載の方法。
前記構築物が、（ａ）配列番号２２から選択されるプロモーター配列、（ｂ）配列番号２３から選択される第ＩＸ因子をコードする核酸配列、及び（ｃ）配列番号２４から選択されるポリＡ配列、のうちの１つ以上を含む、請求項１４に記載の方法。
前記ドナー構築物が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであるか、またはそれを含む、請求項８～１５のいずれか１項に記載の方法。
前記操作のステップが、前記一次Ｂ細胞集団を、二本鎖切断を導入することが可能な標的ヌクレアーゼと接触させることを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
前記標的ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターベースヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはメガヌクレアーゼであるか、またはそれを含む、請求項１７に記載の方法。
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、もしくはＣａｓ１３ａ、またはそのバリアントであるか、あるいはそれを含む、請求項１８に記載の方法。
前記Ｃａｓタンパク質が、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体を形成する、請求項１８に記載の方法。

Description

関連出願の相互参照本出願は、各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２３年４月１７日に出願された米国仮出願第６３／４５９，９８６号、２０２３年５月１６日に出願された同第６３／５０２，６３９号、２０２３年１０月２３日に出願された同第６３／５９２，４９５号、２０２３年１２月８日に出願された同第６３／６０８，１１４号、２０２４年１月２２日に出願された同第６３／６２３，７５６号、及び２０２４年２月１４日に出願された同第６３／５５３，５２０号の利益を主張する。細胞ベースの治療薬は、疾患に対抗するために生得的細胞機構を利用する新たなクラスの医薬品である。従来の治療方法と異なり、細胞療法は、身体内での細胞局在、遊走、及び増殖を利用し、このことが、治療薬の体内分布及び標的送達の改善につながり得る。細胞ベースの療法は、従来の治療選択肢では難治性であるか、または管理することが困難なことが分かっているものが含まれる、広い範囲の疾患に応用できる可能性を有する。本開示は、とりわけ、改変された免疫細胞（例えば、Ｂ系列細胞）を含む組成物及び方法を包含する。本開示は、とりわけ、本明細書に記載の第ＩＸ因子（ＦＩＸ）をコードする１つ以上の核酸配列を含む核酸構築物、及びそれを産生する方法も包含する。本開示は、とりわけ、ＦＩＸを発現する操作されたＢ系列細胞集団を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）を発現する操作されたＢ系列細胞集団を調製する方法であって、方法が、（ａ）一次Ｂ細胞集団が得られるように一次Ｂ細胞を単離するステップと、（ｂ）一次Ｂ細胞集団を活性化するステップと、（ｃ）活性化ステップ中または後に、ＣＣＲ５部位、ＩｇＨ部位、及びＪＣＨＡＩＮ部位から選択される部位にＦＩＸをコードする導入遺伝子を組み込むことによって、一次Ｂ細胞集団を操作し、それによって、操作されたＢ系列細胞集団を生成するステップと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、操作されたＢ系列細胞集団を拡大するステップを更に含む。とりわけ、一態様では、本開示は、操作されたＢ系列細胞集団を形質芽細胞の集団へと分化させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、分化ステップは、操作されたＢ系列細胞集団を、（ａ）ＩＬ－２、（ｂ）ＩＬ－６、（ｃ）ＩＬ－１０、及び／または（ｄ）ＩＬ－１５を含む培養培地と接触させることを含む。とりわけ、一態様では、本開示は、操作されたＢ系列細胞集団を形質細胞の集団へと分化させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、分化ステップは、形質芽細胞の集団を、（ａ）ＩＬ－６、（ｂ）ＩＬ－１５、及び／または（ｃ）ＩＦＮ－アルファ－２－ベータ（ＩＦＮα－２β）を含む培養培地と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｂ系列細胞集団を操作する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、操作されたＢ系列細胞集団を、ヒト血清またはウシ血清を含まない細胞培養培地に約２４時間移植するステップを更に含む。いくつかの実施形態では、操作のステップは、導入遺伝子を含むドナー構築物を一次Ｂ細胞集団に導入することを更に含む。いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、（ａ）二本鎖切断部位に対して５’側の配列に対して少なくとも９５％同一である５’相同性アームと、（ｂ）二本鎖切断部位に対して３’側の配列に対して少なくとも９５％同一である３’相同性アームと、を含む。いくつかの実施形態では、５’相同性アームは、（ｉ）約４５０～８５０塩基対の長さのサイズ、（ｉｉ）ＰＡＭ部位、もしくはＰＡＭ部位の不在、及び／または（ｉｉｉ）３’相同性アームと対称もしくは非対称な長さを含むか、あるいはそれらである。いくつかの実施形態では、３’相同性アームは、（ｉ）約４５０～８５０塩基対の長さのサイズ、（ｉｉ）ＰＡＭ部位、もしくはＰＡＭ部位の不在、及び／または（ｉｉｉ）５’相同性アームと対称もしくは非対称な長さを含むか、あるいはそれらである。いくつかの実施形態では、５’相同性アームは、配列番号１０～１３のうちの１つ以上と少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、３’相同性アームは、配列番号１４～１８のうちの１つ以上と少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、配列番号１９～２１のうちの１つ以上と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、（ａ）配列番号２２から選択されるプロモーター配列、（ｂ）配列番号２３から選択される第ＩＸ因子をコードする核酸配列、及び（ｃ）配列番号２４から選択されるポリＡ配列、のうちの１つ以上を更に含む。いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、操作のステップは、一次Ｂ細胞集団を、二本鎖切断を導入することが可能な標的ヌクレアーゼと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、標的ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターベースヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはメガヌクレアーゼであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、もしくはＣａｓ１３ａ、またはそのバリアントであるか、あるいはそれを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２５～２９のうちのいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を含む。いくつかの実施形態では、操作のステップは、一次Ｂ細胞集団のエレクトロポレーション、及び／またはドナー構築物による一次Ｂ細胞集団の形質導入を更に含む。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションは、（ａ）ｇＲＮＡと複合体を形成するＣａｓタンパク質、及び（ｂ）一次Ｂ細胞集団を含む、組成物に対して実行される。別の態様では、本開示は、Ｂ系列細胞集団の操作のための部位及び導入遺伝子を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＣＲ５部位は、配列番号２５と少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＪＣＨＡＩＮ部位は、１つ以上の配列番号２６～２８と少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＩｇＨ部位は、配列番号２９と少なくとも９５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２３と少なくとも９５％の同一性を有する。別の態様では、本開示は、遺伝子改変されたＢ系列細胞の集団を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたＢ系列細胞の集団は、ＦＩＸタンパク質をコードする導入遺伝子配列を含み、導入遺伝子が、内因性ＣＣＲ５遺伝子座から発現される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたＢ系列細胞の集団は、ＦＩＸタンパク質を発現し、内因性ＣＣＲ５の発現を少なくとも部分的に破壊する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたＢ系列細胞の集団は、ＦＩＸタンパク質をコードする導入遺伝子配列を含み、導入遺伝子が、内因性ＪＣＨＡＩＮ遺伝子座から発現される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたＢ系列細胞の集団は、ＦＩＸタンパク質を発現し、内因性ＪＣＨＡＩＮの発現を少なくとも部分的に破壊する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたＢ系列細胞の集団は、ＦＩＸタンパク質をコードする導入遺伝子配列を含み、導入遺伝子が、内因性ＩｇＨ遺伝子座から発現される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたＢ系列細胞の集団は、ＦＩＸタンパク質を発現し、内因性ＩｇＨの発現を少なくとも部分的に破壊する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたＢ系列細胞の集団は、遺伝子改変された形質細胞の集団であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたＢ系列細胞の集団は、形質芽細胞の集団であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたＢ系列細胞の集団は、形質細胞前駆体の集団であるか、またはそれを含む。別の態様では、本開示は、遺伝子改変されたＢ系列細胞の集団から選択される１つ以上のＢ系列細胞を含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、遺伝子改変されたＢ系列細胞の集団から選択される１つ以上のＢ系列細胞を含み、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を更に含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物を投与する方法であって、医薬組成物が、（ａ）本明細書に記載の任意の態様または実施形態の遺伝子改変されたＢ系列細胞の集団から選択される１つ以上のＢ系列細胞と、（ｂ）薬学的に許容される１つ以上の賦形剤と、を含み、医薬組成物が、対象に投与される、方法。別の態様では、本開示は、対象における疾患、障害、または状態を治療する方法であって、方法が、治療有効量の医薬組成物を対象に投与し、それによって、対象における疾患、障害、または状態を治療することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、成人対象に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、小児対象に投与される。いくつかの実施形態では、対象は、血友病Ｂを有する。別の態様では、本開示は、遺伝子改変されたＢ系列細胞の集団を特徴付ける方法であって、方法が、アッセイを使用して、（ａ）～（ｇ）：（ａ）ＣＤ３８マーカーの存在、（ｂ）ＣＤ１３８マーカーの存在、（ｃ）少なくとも５０％のＣＤ２７マーカーの存在、（ｄ）少なくとも０．５ｐｇ／細胞／日のＩｇＧの分泌、（ｅ）少なくとも２．５ｐｇ／細胞／日のＩｇＭの分泌、（ｆ）少なくとも０．５ｐｇ／細胞／日のＩｇＤの分泌、及び（ｇ）少なくとも０．１ｐｇ／細胞／日のＦＩＸタンパク質の分泌、のうちの１つ以上を評価することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、アッセイは、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣ選別）、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ＥＬＩＳｐｏｔ）、及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のうちの１つ以上を含むか、またはそれらである。いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたＢ系列細胞の集団から選択される１つ以上のＢ系列細胞は、対象の骨髄内に生着する。いくつかの実施形態では、生物発光、ＥＬＩＳｐｏｔ、フローサイトメトリー、及び酵素結合免疫吸着アッセイのうちの１つ以上を含む、対象内の遺伝子改変されたＢ系列細胞の生着をモニタリングする方法。図面は、例示のみを目的としており、限定を目的としていない。以下の発現カセット：ｐ００５７３（ＡＭＴ０６１）、ｐ００５７６（ゼロＣＧ．ＡＨ）、及びｐ００５７７（ゼロＣＧ．ＳＳ）を含むＡＡＶ６ウイルスベクターを示す。各発現カセットは、組み込みのための５’及び３’相同性アーム（ＨＡ）、ＭＮＤプロモーター、及びＢＧＨポリアデニル化（ポリＡ）配列を含む。発現カセットの各々は、本明細書に記載のＦＩＸをコードする異なるポリヌクレオチド：ＡＭＴ０６１、ゼロＣＧ．ＡＨ、及びゼロＣＧ．ＳＳを含有する。ＥＬＩＳＡアッセイを介して左から右に、以下の操作されていないＢ系列細胞における免疫グロブリンＧ産生（ＩｇＧ－）、操作されたＢ系列細胞におけるＩｇＧ産生（ＩｇＧＳＶ）、及び操作されたＢ系列細胞における第ＩＸ因子産生（ＦＩＸＳＶ）を実証する。操作されたＢ系列細胞における第ＩＸ因子対免疫グロブリンＧの比を実証する。例示的なＦＩＸ発現カセットと、ＣＣＲ５標的化ガイドＲＮＡ（ｇＣＣＲ５＿２３２）またはＪＣＨＡＩＮ標的化ガイドＲＮＡ（ｇＪＣＨＡＩＮ＿２）のいずれかとで操作したＢ系列細胞集団において、ＥＬＩＳＡを介して測定した第Ｉ