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JP-2026514772-A - ミスフォールドポリペプチドを検出するためのナノ粒子強化型の方法及び材料

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Abstract

本文書は試料中のミスフォールドポリペプチドの存在又は不在を検出するための方法及び材料に関する。例えば、試料(例えば生物試料又は環境試料)を、シード増幅アッセイ中にナノ粒子(例えば、サイズ2μm以下（例えばサイズ1μm以下）を有するナノ粒子、例えばサイズ2μm以下を有するシリカナノ粒子(siNP)（例えばサイズ1μm以下を有するsiNP）)に曝露して、フィブリル及び/又はポリペプチド凝集体(例えば球状ポリペプチド凝集体)への、試料中に存在するミスフォールドポリペプチドの凝集を加速することができる。場合によっては、本明細書で提供される方法及び材料を使用して、哺乳動物(例えばヒト)から得られた試料中のミスフォールドポリペプチドの存在又は不在に少なくとも部分的に基づいて、当該哺乳動物がタンパク質症を有するかどうか判定することができる。 【選択図】なし

Inventors

  • オー，サン－ヒュン
  • ラーセン，ピーター エー．
  • クリステンソン，ピーター シー．
  • リー，マンシ
  • ローデン，ゲージ

Assignees

  • リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ

Dates

Publication Date
20260513
Application Date
20240418
Priority Date
20230418

Claims (20)

  1. 試料中のミスフォールドポリペプチドの存在又は不在を検出するための方法であって、 (a)前記試料を、シード増幅アッセイ中にサイズ1μm以下を有するナノ粒子に曝露するステップであって、ミスフォールドポリペプチドが前記試料内に存在する場合にフィブリルを形成する、ステップ、 (b)ステップ(a)で形成された場合に前記フィブリルを検出するステップ、 (c)前記フィブリルが検出される場合、前記ミスフォールドポリペプチドの前記存在を有すると前記試料を特定するステップ、及び (d)前記フィブリルが検出されない場合、前記ミスフォールドポリペプチドはないと前記試料を特定するステップ を含む、方法。
  2. 前記試料が生物試料である、請求項1に記載の方法。
  3. 前記生物試料が生きている哺乳動物から得られたものである、請求項2に記載の方法。
  4. 前記生きている哺乳動物が、ヒト、サル、ラクダ、ウマ、ミンク、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、マウス、ラット、ハムスター、マザマジカ、アクシスジカ、エルク、ダマジカ、アメリカヌマジカ、ミュールジカ、ムンジャク、ムース、パンパスジカ、アカシカ、トナカイ、ノロジカ、サンバージカ、ニホンジカ、オジロジカ、アンテロープ及びヤギからなる群から選択される、請求項3に記載の方法。
  5. 前記生物試料が、リンパ組織、筋肉組織、扁桃組織、皮膚組織、脳組織、脳幹組織、血液、脳脊髄液、尿、糞便、唾液、粘液、肝臓組織、心臓組織、腸組織、精液、脾臓組織及び眼組織からなる群から選択される、請求項3又は請求項4に記載の方法。
  6. 前記生物試料が死後の哺乳動物から得られたものである、請求項2に記載の方法。
  7. 前記生物試料が牛肉、羊肉、子羊肉又は鹿肉である、請求項6に記載の方法。
  8. 前記試料が環境試料である、請求項1に記載の方法。
  9. 前記環境試料が土壌、水、塵埃及び植物から選択される、請求項8に記載の方法。
  10. 前記環境試料が綿棒又はフィルターを使用して得られたものである、請求項8又は請求項9に記載の方法。
  11. 前記環境試料が、自然生息地、水路、農場、食品加工施設、水処理施設及び医療施設からなる群から選択される場所から得られたものである、請求項8から10のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記環境試料が前記食品加工施設から得られたものであり、前記食品加工施設が哺乳動物の消費向けの食品を加工する、請求項11に記載の方法。
  13. 前記環境試料が前記医療施設から得られたものである、請求項11に記載の方法。
  14. 前記ステップ(a)に先立ち前記試料からポリペプチドを単離するステップを含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記シード増幅アッセイが、前記試料を振とうすること、前記試料を超音波処理すること、前記試料を音波に曝露すること、又は前記試料の光照射を含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記ミスフォールドポリペプチドが、プリオンタンパク質(PrP)ポリペプチド、タウポリペプチド、アミロイドβポリペプチド、α-シヌクレインポリペプチド、TDP-43ポリペプチド、膵島アミロイドポリペプチド(IAPP)、スーパーオキシドジスムターゼ1(SOD1)ポリペプチド、ハンチンチンポリペプチド、融合肉腫(FUS)ポリペプチド、及び転座脂肪肉腫(TLS)ポリペプチドからなる群から選択される、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記ミスフォールドポリペプチドがタンパク質症に関連する、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記タンパク質症が、慢性消耗病(CWD)、クロイツフェルト・ヤコブ病、伝染性ミンク脳症、スクレイピー、ネコ海綿状脳症、有蹄類海綿状脳症、ウシ海綿状脳症、ラクダ海綿状脳症、下垂体中間部機能不全(PPID)、アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、ピック病、レビー小体型認知症(LBD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、及び慢性外傷性脳症からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
  19. 前記シード増幅アッセイが約96時間未満で完了する、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記ナノ粒子が、シリカナノ粒子、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、白金ナノ粒子、鉄ナノ粒子、銅ナノ粒子、金属殻を有する誘電体ナノ粒子、二酸化チタンナノ粒子、二酸化スズナノ粒子、酸化セリウムナノ粒子、二酸化ジルコニウムナノ粒子、酸化鉄ナノ粒子、テルル化カドミウム量子ドット、及び硫化鉛量子ドットからなる群から選択される、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。

Description

関連出願の相互参照 本出願は2023年4月18日出願の米国特許出願第63/460,179号の利益を主張する。先行出願の開示は本出願の開示の一部とみなされ、参照により本出願に組み込まれる。 本文書は試料中のミスフォールドポリペプチドの存在又は不在を検出するための方法及び材料に関する。例えば、試料(例えば生物試料又は環境試料)を、シード増幅アッセイ中にナノ粒子(例えば、サイズ2μm以下を有するナノ粒子、例えばサイズ2μm以下を有するシリカナノ粒子(siNP))に曝露して、フィブリル及び/又はポリペプチド凝集体(例えば球状ポリペプチド凝集体)への、試料中に存在するミスフォールドポリペプチドの凝集を加速することができる。例えば、試料(例えば生物試料又は環境試料)を、シード増幅アッセイ中にナノ粒子(例えば、サイズ1μm以下を有するナノ粒子、例えばサイズ1μm以下を有するsiNP)に曝露して、フィブリル及び/又はポリペプチド凝集体(例えば球状ポリペプチド凝集体)への、試料中に存在するミスフォールドポリペプチドの凝集を加速することができる。場合によっては、本明細書で提供される方法及び材料を使用して、哺乳動物(例えばヒト)から得られた試料中のミスフォールドポリペプチドの存在又は不在に少なくとも部分的に基づいて、当該哺乳動物がタンパク質症を有するかどうか判定することができる。 ミスフォールドポリペプチドによって形成される病的アミロイドは、アルツハイマー病(ミスフォールドAβ及びタウ)、パーキンソン病(ミスフォールドα-シヌクレイン)及びプリオン病(ミスフォールド細胞性プリオンタンパク質、PrPC)を含めて、ヒトと動物の両方の多くの神経変性疾患で見出される(Prusiner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 (23), 13363-13383 (1998)、Soto et al., Arch. Neurol., 65 (2), 184-189 (2008)、Marsh et al., J. Virol., 79 (21), 13794-13796 (2005)、及びKim et al., Sci. Rep., 6:19548 (2016))。病原性タンパク質アイソフォームにわたって観察されるアミロイド形成は、不溶性且つ分解耐性のアミロイドフィブリルへの、機能性ポリペプチドのミスフォールドを介して起こる。神経変性疾患広範囲にわたる注目すべき特徴とは、関連するミスフォールドポリペプチドの生成及び沈着が臨床症状の発症の何年も前に始まるおそれがあることである。 リアルタイム振動誘発型変換(Real-time quaking-induced conversion)(RT-QuIC)が、種々のミスフォールドポリペプチド関連の神経変性疾患の早期診断に向けた最も感度が高く且つ有望なアッセイの一つとして浮かび上がってきた(Iranzo et al., Lancet Neurol., 20 (3), 203-212 (2021)、Dong et al., Pathogens, 10(3):305 (2021)、Coysh et al., Front. Aging Neurosci., 14, 872629 (2022)、Telling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 116 (46), 22894-22896 (2019)、及びHaley et al., Pathogens, 6(3):35 (2017))。RT-QuICは、さまざまな神経変性疾患に関連するいくつかのミスフォールドポリペプチド(例えば、TDP-43、タウ、アルファ-シヌクレイン、感染性プリオン等)を検出するのに首尾よく適用されてきたが、一方、生物試料の複雑性によって臨床診断の適用に対して依然として課題がもたらされている。例えば、上記アッセイは標準検査を完了するのに最大48時間を要する場合が多い。加えて、生物試料内に存在する天然の阻害因子が反応速度論に干渉し、その結果、偽陰性の結果をもたらす場合がある(Davenport et al., J. Clin. Microbiol., 56(9):e00947-18 (2018)、Coysh et al., Front. Aging Neurosci., 14, 872629 (2022)、Li et al., Sci. Rep., 11(1):16759 (2021)、及びOrru et al., "Real-Time Quaking-Induced Conversion (QuIC) Assays for the Detection and Diagnosis of Human Prion Diseases." pages 621-635 in Prions and Diseases、Zou et al., (Eds); Springer International Publishing: Cham, 2023)。 本文書は、試料中のミスフォールドポリペプチド、ポリペプチドフィブリル及び/又はポリペプチド凝集体(例えば球状ポリペプチド凝集体)の存在又は不在を検出するための方法及び材料を提供する。ミスフォールドポリペプチドは蓄積して、凝集体(例えば、2つ以上のミスフォールドポリペプチドの凝集体)、例えば、フィブリル(例えばアミロイドフィブリル)、ポリペプチド凝集体(例えば球状ポリペプチド凝集体)、及び/又はオリゴマーを形成する可能性がある。例えば、試料(例えば生物試料又は環境試料)を、シード増幅アッセイ中にナノ粒子(例えば、サイズ2μm以下を有するナノ粒子、例えばサイズ2μm以下を有するsiNP)に曝露して、フィブリル及び/又はポリペプチド凝集体への、試料中に存在するミスフォールドポリペプチドの凝集を加速することができる。例えば、試料(例えば生物試料又は環境試料)を、シード増幅アッセイ中にナノ粒子(例えば、サイズ1μm以下を有するナノ粒子、例えばサイズ1μm以下を有するsiNP)に曝露して、フィブリル及び/又はポリペプチド凝集体への、試料中に存在するミスフォールドポリペプチドの凝集を加速することができる。ナノ粒子の存在によって加速されるシード増幅アッセイは、ナノ粒子強化型シード増幅アッセイ、例えばナノ粒子強化型RT-QuIC(Nano-QuIC)と呼ばれる場合がある。 場合によっては、試料(例えば生物試料又は環境試料)を、シード増幅アッセイ中にナノ粒子(例えば、サイズ2μm以下(例えば1μm以下)を有するナノ粒子、例えば、サイズ2μm以下(例えば1μm以下)を有するsiNP)に曝露することができる。例えば、シード増幅アッセイは、(a)試料(例えば、ミスフォールドポリペプチドを含有する疑いがある試料)をポリペプチド基質(例えば、組換えPrP基質、例えば組換えハムスターPrP(rPrP))と接触させて混合物を形成すること、及び(b)上記混合物を一定時間撹拌することを含むことができる。場合によっては、本明細書で提供される方法及び材料を使用して、哺乳動物(例えばヒト)から得られた試料中のミスフォールドポリペプチドの存在又は不在に少なくとも部分的に基づいて、当該哺乳動物がタンパク質症を有するかどうか判定することができる。例えば、哺乳動物から得られた試料を、シード増幅アッセイ中にナノ粒子(例えば、サイズ2μm以下(例えば1μm以下)を有するナノ粒子、例えば、サイズ2μm以下(例えば1μm以下)を有するsiNP)に曝露して、フィブリル及び/又はポリペプチド凝集体への、試料中に存在するミスフォールドポリペプチドの凝集を加速することができ、フィブリル及び/又はポリペプチド凝集体の存在又は不在を検出することができ、フィブリル及び/又はポリペプチド凝集体の存在が検出される場合にタンパク質症を有すると当該哺乳動物を分類することができる。 本明細書で実証されるように、サイズ2μm以下(例えば1μm以下)を有するナノ粒子(例えばsiNP)をシード増幅アッセイ(例えばRT-QuIC反応)に添加することで、増幅(例えば、ミスフォールドポリペプチドの凝集)を加速することができる。例えば、サイズ2μm以下(例えば1μm以下)を有するナノ粒子(例えばsiNP)をRT-QuIC反応に添加することで、RT-QuIC反応中にアミロイド形成速度を向上させることができる。場合によっては、サイズ2μm以下(例えば1μm以下)を有するナノ粒子(例えばsiNP)をRT-QuIC反応に添加することで、RT-QuIC反応の感度も向上させることができる。 本明細書に記載のように試料中のミスフォールドポリペプチドの存在を検出する能力(例えば、試料をシード増幅アッセイ中にサイズ2μm以下(例えば1μm以下)を有するナノ粒子(例えばsiNP)に曝露することにより)を有することで、ミスフォールドポリペプチドの存在を迅速且つ効果的に検出するための加速された方法が提供される。例えば、本明細書に記載の方法は、比較的使用し易く、安価な試薬及び機器を必要とし、標的タンパク質に対して高感度で高度に特異的であり、多様な設定(例えば現場、小規模な研究室等で)で実施することができ且つ約4時間以内で(例えば約4時間内で、約3時間内で、約2時間内で又はそれ未満で)実施することができる、タンパク質ベースの診断方法を提供する。場合によっては、本明細書に記載の方法及び材料を使用して、タンパク質症を有すると哺乳動物を迅速且つ容易に特定することができる。 全体として、本文書の一態様は、試料中のミスフォールドポリペプチドの存在又は不在を検出するための方法を特徴とし、ここで、本方法は、(a)試料を、シード増幅アッセイ中にサイズ2μm以下(例えば1μm以下)を有するナノ粒子に曝露するステップであって、ミスフォールドポリペプチドは前記試料内に存在する場合にフィブリルを形成する、ステップ、(b)ステップ(a)で形成された場合に前記フィブリルを検出するステップ、(c)前記フィブリルが検出される場合、前記ミスフォールドポリペプチドの前記存在を有すると前記試料を特定するステップ、及び(d)前記フィブリルが検出されない場合、前記ミスフォールドポリペプチドはないと前記試料を特定するステップを含むか又はそれらから本質的になることができる。試料は生物試料とすることができる。生物試料は生きている哺乳動物から得ることができる。生きている哺乳動物は、ヒト、サル、ラクダ、ウマ、ミンク、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、マウス、ラット、ハムスター、マザマジカ、アクシスジカ、エルク、ダマジカ、アメリカヌマジカ、ミュールジカ、ムンジャク、ムース、パンパスジカ、アカシカ、トナカイ、ノロジカ、サンバージカ、ニホンジカ、オジロジカ、アンテロープ又はヤギとすることができる。生物試料は、リンパ組織、筋肉組織、扁桃組織、皮膚組織、脳組織、脳幹組織、血液、脳脊髄液、尿、糞便、唾液、粘液、肝臓組織、心臓組織、腸組織、精液、脾臓組織又は眼組織とすることができる。生物試料は死後の哺乳動物から得ることができる。生物試料は牛肉、羊肉、子羊肉又は鹿肉とすることができる。試料は環境試料とすることができる。環境試料は土壌、水、塵埃又は植物とすることができる。環境試料は綿棒又はフィルターを使用して得ることができる。環境試料は、自然生息地、水路、農場、食品加工施設、水処理施設及び医療施設からなる群から選択される場所から得ることができる。環境試料は前記食品加工施設から得ることができ、前記食品加工施設は哺乳動物の消費向けの食品を加工する。環境試料は前記医療施設から得ることができる。本方法は、前記ステップ(a)に先立ち前記試料からポリペプチドを単離するステップを含むことができる。シード増幅アッセイは、前記試料を振とうすること、前記試料