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JP-2026514802-A - 高リボ核酸酵母のハイスループット高速育種方法

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Abstract

高リボ核酸酵母のハイスループット高速育種方法である。提供される高リボ核酸酵母のハイスループット育種方法は、微生物変異体ライブラリーを構築するステップ（１）と、ステップ（１）で得られた菌体を復元するステップ（２）と、変異体ライブラリーを適応進化するステップ（３）と、進化ライブラリーのハイスループットスクリーニングにより高ＲＮＡの酵母を得るステップ（４）と、を含む。提供される方法を採用し、高ＲＮＡの酵母菌株を効率的にスクリーニングし、優勢菌株を迅速に育種することができ、スクリーニングされた優勢菌株のＲＮＡ含有量は１５％以上に達することができる。 【選択図】なし

Inventors

  • 伍 業旭
  • 肖 明華
  • 胡 悦
  • 張 彦
  • 雷 森林
  • 黄 興法

Assignees

  • 安▲チー▼酵母股▲ふん▼有限公司

Dates

Publication Date
20260513
Application Date
20240619
Priority Date
20230419

Claims (10)

  1. 高リボ核酸酵母のハイスループット育種方法であって、 酵母変異体菌体の微生物変異体ライブラリーを構築するステップ（１）と、 ステップ（１）で得られた菌体を復元するステップ（２）と、 変異体ライブラリーを適応進化するステップ（３）と、 適応進化したライブラリーのハイスループットスクリーニングにより高ＲＮＡの酵母を得るステップ（４）と、を含む、ことを特徴とする高リボ核酸酵母のハイスループット育種方法。
  2. ステップ（１）において、前記微生物変異体ライブラリーを構築するステップは、化学的変異誘発、物理的変異誘発又は化学的変異誘発と物理的変異誘発の組み合わせを採用する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 化学的変異誘発剤は、メタンスルホン酸エチル、硫酸ジエチル、アジ化ナトリウムの１種又は２種以上の組み合わせであり、 好ましくは、化学的変異誘発剤の作用濃度は１～６％（ｗ／ｖ）であり、 より好ましくは、作用時間は０．５～２ｈである、ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
  4. 物理的変異誘発は、紫外線放射及び常圧室温プラズマの１種又は２種以上の組み合わせを採用し、好ましくは、物理的変異誘発の時間は３０ｓ～９０ｓであり、 好ましくは、常圧室温プラズマの出力は８０～１２０Ｗであり、ガス流量は８～１５Ｌ／ｍｉｎであり、より好ましくは、常圧室温プラズマの出力は１００Ｗであり、ガス流量は１０Ｌ／ｍｉｎであり、 さらに好ましくは、紫外線放射の出力は１５ｗ～２０ｗであり、照射距離は２０～３０ｃｍである、ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
  5. ステップ（２）において、菌体を培地中で静置培養し、 好ましくは、前記培地はＹＰＤ培地であり、 より好ましくは、培地のｐＨは５．０～６．０であり、 さらに好ましくは、培養温度は２８～３２℃であり、 よりさらに好ましくは、培養時間は３０～６０ｍｉｎである、ことを特徴とする請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. ステップ（３）において、ステップ（２）で得られた復元した菌体を抑制物質を含む進化培地中で培養し、そして培養液を採取して新たな進化培地に継代接種して培養し、５０～１５０回繰り返して継代接種し、 好ましくは、前記抑制物質は、６－アザウラシル、８－アザグアニン、シクロヘキシミド、６－メルカプトプリン、ジアミノプリン、５－ブロモウラシル、５－フルオロウラシルの１種又は２種以上の組み合わせであり、 より好ましくは、継代接種後の培地中の抑制物質の濃度は高くなり、 さらに好ましくは、継代接種過程において、培地中の抑制物質の濃度は５０～１０００ｍｇ／Ｌ高くなり、 よりさらに好ましくは、２０～３０ｈ培養した後に継代接種し、好ましくは２４ｈであり、 よりさらに好ましくは、培養温度は２８～３３℃であり、１５０～２２０ｒｐｍで振とう培養し、 よりさらに好ましくは、抑制物質の濃度は５０ｍｇ～１０００ｍｇ／Ｌであり、好ましくは、抑制物質の濃度は５０ｍｇ～５００ｍｇ／Ｌであり、 よりさらに好ましくは、抑制物質の初期濃度は５０ｍｇ～１００ｍｇ／Ｌである、ことを特徴とする請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. ステップ（４）において、ＲＮＡ蛍光色素を用いて変異誘発ライブラリーを染色し、蛍光強度の高い菌株を選抜することで高ＲＮＡの酵母を得、 好ましくは、前記ＲＮＡ蛍光色素はＳＹＴＯ（登録商標）ＲＮＡＳｅｌｅｃｔ（商標）、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ＲＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔ又は臭化エチジウムの１種又は２種以上の組み合わせであり、好ましくはＳＹＴＯ（登録商標）ＲＮＡＳｅｌｅｃｔである、ことを特徴とする請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記方法は、スケールアップ検証するステップ（５）をさらに含む、ことを特徴とする請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. ステップ（５）において、発酵槽においてステップ（４）で選別した菌株に対して発酵検証を行い、そのＲＮＡ含有量を測定する、ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
  10. 発酵培地は、質量百分率で表すと、ブドウ糖２～６％、酵母エキス０．５～２％、硫酸マグネシウム七水和物０．２～０．４％、硫酸亜鉛七水和物０．２～０．４％、リン酸二水素カリウム０．５～１．２％、残部の水を含み、 好ましくは、前記発酵培地のｐＨは５．０～６．０であり、 より好ましくは、発酵撹拌回転数は３００～６００ｒｐｍであり、 さらに好ましくは、発酵通気量は３～６Ｌ／ｍｉｎである、ことを特徴とする請求項９に記載の方法。

Description

本発明は、生物工学技術に関し、具体的には、微生物菌株のハイスループットスクリーニング方法に関する。 リボ核酸（即ちＲＮＡ、Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）は重要な生体高分子の一種であり、食品調味料、栄養保健、生物医薬などの分野に広く応用されている。現在、ＲＮＡの工業的生産は主に純粋培養したカンジダ酵母、サッカロマイセス・セレビシエ又はビール酵母から抽出することにより行われている。サッカロマイセス・セレビシエは、いずれの毒素も生成せず、食品安全レベル（ＧＲＡＳ）微生物であり、且つ増殖・継代速度が速く、培養が容易で栄養価に富むため、公認された最も理想的なＲＮＡ源である。 サッカロマイセス・セレビシエのＲＮＡ含有量が比較的低く、平均で６％～８％であるため、サッカロマイセス・セレビシエから誘導されたＲＮＡ、ヌクレオチドなどの製品のコストが高くなっている。生産コストを削減し、製品の競争力を高めるためには、酵母菌株のＲＮＡ含有量をさらに向上させる必要がある。 図１に示すのは適応進化菌体ＯＤ６００及びＲＮＡ含有量の抑制物質濃度に伴う変化状況であり、ここで、（ａ）に示すのは適応進化菌体ＯＤ６００の変化状況であり、（ｂ）に示すのは適応進化ＲＮＡ含有量の変化状況である。図２に示すのは酵母細胞内のＲＮＡ含有量と蛍光強度との関係であり、ここで、（Ａ）に示すのは酵母細胞内のＲＮＡ含有量と蛍光強度との関係であり、（Ｂ）に示すのは酵母細胞内のＲＮＡ含有量と蛍光強度との相関分析である。図３に示すのはフローサイトメトリーによる細胞選別結果であり、ここで、（ａ）に示すのは出発菌株の蛍光強度と側方散乱強度との関係であり、（ｂ）に示すのは出発菌株の蛍光強度と細胞個数との関係であり、（ｃ）に示すのは変異誘発進化ライブラリーの蛍光強度と側方散乱強度との関係であり、（ｄ）に示すのは変異誘発進化ライブラリーの蛍光強度と細胞個数との関係である。図４に示すのは優勢菌株の３Ｌ発酵槽におけるスケールアップ検証結果であり、ここで、（ａ）に示すのは実施例１、２、３で得られた菌株及び出発菌株サッカロマイセス・セレビシエＦＸ－２菌株の３Ｌ発酵槽におけるバイオマス及びＲＮＡ結果であり、（ｂ）に示すのは実施例７、８、９で得られた菌株及び出発菌株サッカロマイセス・セレビシエＦＸ－２菌株の３Ｌ発酵槽におけるバイオマス及びＲＮＡ結果である。 本発明にて提供される高核酸酵母のハイスループット育種方法は、蛍光値によってＲＮＡ含有量を反映し、フローサイトメトリーによる細胞選別技術を採用し、ＲＮＡ含有量が高い優勢菌株を迅速に育種する。 ハイスループットスクリーニングは、従来のスクリーニングに比べてより効率的な方法である。本発明にて提供される高核酸酵母のハイスループット育種方法は、大規模スクリーニング過程において、まずＲＮＡ染料を用いて酵母細胞を染色し、染色後の細胞は特定の波長で蛍光を発し、蛍光強度とＲＮＡ含有量は正の相関を呈し、フローサイトメーターを用いて染色後の細胞に対して蛍光分析を行い、蛍光強度が高い（即ちＲＮＡ含有量が高い）細胞を迅速にスクリーニングすることができる。 本発明にて提供される具体的な実施形態において、下記ステップを含む方法によって高核酸酵母をスクリーニングする。 （１）微生物変異体ライブラリーの構築： 本発明の具体的な実施形態において、変異誘発によって微生物変異体ライブラリーを得、 本発明の具体的な実施形態において、前記変異誘発は、化学的変異誘発、物理的変異誘発又は化学的変異誘発と物理的変異誘発の組み合わせである。 本発明の具体的な実施形態において、化学的変異誘発剤は、メタンスルホン酸エチル、硫酸ジエチル、アジ化ナトリウムから選択される１種又は２種以上の組み合わせであり、 本発明の具体的な実施形態において、化学的変異誘発剤の作用濃度は１～６％（ｗ／ｖ）であり、作用時間は０．５～２ｈである。 本発明の具体的な実施形態において、物理的変異誘発方法は、紫外線放射、常圧室温プラズマの１種又は２種以上の組み合わせであり、 本発明の具体的な実施形態において、物理的変異誘発の時間は３０ｓ～９０ｓである。 （２）菌体の復元： 本発明の具体的な実施形態において、変異誘発された菌体を培地に入れて静置培養し、本発明の好ましい実施形態において、前記培地はＹＰＤ培地であり、ｐＨ５．０～６．０であり、３０℃で３０～６０ｍｉｎ静置培養する。 （３）変異体ライブラリーの適応進化： 本発明の具体的な実施形態において、復元した菌体を、抑制物質を含む進化培地に継代接種して振とう培養し、２０～３０ｈ培養した後に継代接種し、新鮮な進化培地に移して培養し続け、繰り返して継代接種する。且つ継代接種培養過程において、抑制物質の濃度を段階的に高める。 本発明の具体的な実施形態において、進化培地中の抑制物質は、６－アザウラシル、８－アザグアニン、シクロヘキシミド、６－メルカプトプリン、ジアミノプリン、５－ブロモウラシル、５－フルオロウラシルの１種又は２種以上の組み合わせである。 本発明の具体的な実施形態において、抑制物質の初期濃度は、５０ｍｇ～１００ｍｇ／Ｌである。 （４）進化ライブラリーのハイスループットスクリーニング： 本発明の具体的な実施形態において、ＲＮＡ特異的な蛍光色素を用いて変異誘発ライブラリーを染色し、染色後にフローサイトメーターを用いて個々の細胞に対して蛍光分析を行い、蛍光強度と酵母細胞内のＲＮＡ含有量が正の相関を呈する特性を利用して蛍光強度が高い（即ちＲＮＡ含有量が高い）菌株を選別する。 （５）スケールアップ検証： 本発明の具体的な実施形態において、さらに発酵槽において前のステップで選別した菌株に対して発酵検証を行い、そのＲＮＡ含有量を測定することができる。 本発明の具体的な実施形態において、発酵培地は、質量百分率で表すと、ブドウ糖２～６％、酵母エキス０．５～２％、硫酸マグネシウム七水和物０．２～０．４％、硫酸亜鉛七水和物０．２～０．４％、リン酸二水素カリウム０．５～１．２％、残部の水であり、ｐＨ５．０～６．０であり、 本発明の具体的な実施形態において、３００～６００ｒｐｍで撹拌し、３～６Ｌ／ｍｉｎで通気し、一定時間ごとにそのバイオマス及びＲＮＡ含有量を測定する。 本発明の実施例において常圧室温プラズマを用いて変異誘発を行い、その変異誘発の出力は１００Ｗであり、ガス流量は１０Ｌ／ｍｉｎであり、 本発明の実施例において紫外線放射を用いて変異誘発を行い、その変異誘発の出力は１５ｗ～２０ｗであり、照射距離は３０ｃｍである。 本発明の実施例におけるバイオマス及びＲＮＡ含有量の検出方法は以下のとおりである。 バイオマス検出方法：１．１０ｍＬの遠心管を採取し、空の遠心管の重量ｍ１を精密に秤量し、２．発酵液１０ｍＬを精密に採取し、５０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた後、１０５℃で恒量になるまで乾燥させ、重量ｍ２を秤量し、３．バイオマスＤＣＷ（ｇ／Ｌ）＝（ｍ２－ｍ１）＊１００である。 ＲＮＡ検出方法： 試薬：１．０．５Ｎ過塩素酸（ＨＣｌＯ４）：４００ｍＬの蒸留水を採取して２１．５ｍＬ ７０％（又は２２．１ｍＬ ６８％）の過塩素酸を加え、さらに蒸留水で５００ｍＬに定容する。 ２．０．２５Ｎ過塩素酸（ＨＣｌＯ４）：２５０ｍＬの０．５Ｎ過塩素酸（ＨＣｌＯ４）を採取して蒸留水で５００ｍＬに希釈する。 装置：（１）ミリグラム級天秤、（２）４０００回転遠心分離機（酵母の分離が可能）、（３）遠心試験管（容量が少なくとも１０ｍＬ）、（４）分光光度計（２６０ｎｍ）、（５）７０℃湯浴、（６）４℃冷水浴、（７）１０ｍＬ及び１ｍＬのピペットガン、（８）１００ｍＬのメスフラスコ。 方法： １．酵母乾燥粉末であれば、０．０６～０．１５ｇの酵母を秤量して遠心管に加え、１８％の酵母乳であれば、０．４～０．８ｇを秤量し、３．５％の液体であれば、１．５～３．０ｇを秤量する。 ２．８ｍＬの冷たい０．２５Ｎ ＨＣｌＯ４を遠心管に加え、４℃で１５ｍｉｎ水浴する。 ３．４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離する。 ４．表面に浮いている物質をゆっくりと捨て、０．５ＮのＨＣｌＯ４ ５ｍＬを加えて振とうして均一に混合し、７０℃で１５ｍｉｎ水浴し、３～４ｍｉｎごとに１回振とうする。４０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、１ｍＬの上清液を吸引し、蒸留水で１００ｍＬに定容する。 ５．２６０ｎｍで吸光度を測定し、蒸留水をブランク対照とする。 計算公式：乾燥酵母中％ＲＮＡ＝（吸光度×希釈倍数×０．０３３６５×５）／（試料質量×試料の固形物百分率）×１００％ 本発明における乾燥酵母中のＲＮＡ含有量の計算過程において、試料重量はミリグラム単位で換算し、例えば、秤量した乾燥酵母の重量が１４５ｍｇであり、吸光度が０．７であり、固形物含有率が９６％であり、得られた乾燥酵母中のＲＮＡ含有量の計算過程：％ＲＮＡ＝（０．７×１００×０．０３３６５×５）／（１４５ｍｇ×０．９６）×１００％。 本発明に係る関連名詞の解説： ＯＤ２６０／ＯＤ６００とは、単位菌体のＲＮＡ含有量を指す。 ＦＶ／ＯＤ６００とは、単位菌体の蛍光強度（染色後）を指す。 ＤＣＷとは、菌体の乾燥重量を指す。 以下の各実施例で使用した各試薬及び機器の出所は、下記の表１に示すとおりである。 本発明で採用されたサッカロマイセス・セレビシエＦＸ－２（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＦＸ－２）は２０１６年８月１日に中国典型培養物保存センター（ＣＣＴＣＣ）に寄託され、寄託番号がＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０１６４１８である。該菌株は開示番号がＣＮ１０８２２０１７５Ａの特許公開公報に記載されている。 （実施例１） 出発菌株の変異誘発：サッカロマイセス・セレビシエＦＸ－２を１００ｍＬのＹＰＤ培地に、３０℃、２００ｒｐｍで２４ｈ振とう培養した後、１ｍＬの菌液を吸引し、１２０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離して菌体を収集し、リン酸塩緩衝液で２回洗浄沈殿し、調製済みの５％（１００ｍＬ当たりの溶液にメタンスルホン酸エチル質量５ｇを含む）のメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）１ｍＬを加え、均一に混合し、３０℃、５０ｒｐｍで３０ｍｉｎ振とうした後に遠心分離し、２回洗浄沈殿した。 菌体の復元：上記菌体沈殿に５ｍＬのＹＰＤ培地を加えて再懸濁し、３０℃で６０ｍｉｎ静止培養した後に５０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離して菌体を収集した。 変異誘発ライブラリーの適応進化：６．７ｇのＹＮＢ、２０ｇの硫酸アンモニウム、１００ｍｇの６－アザウラシルを１Ｌの進化培地溶液に調製し、０．２２μｍで濾過して除菌し、５０ｍＬの進化培地を採取して上記菌体を再懸濁し、３０℃、２００ｒｐｍで２４ｈ振とう培養した後、０．５ｍＬの培養液を吸引して新鮮な進化培地に移して２４ｈ培養し続け、このように５０回繰り返して継代接種し、且つ抑制物質の濃度を２００、３００、４００、５００ｍｇ／Ｌに段階的に高めた。進化が終了した後、最終培養で得られた菌液を採取し、遠心分離して菌体を収集し、得られた菌体ＯＤ６００及びＲＮＡ含有量の抑制物質濃度に伴う変化状況を図１に示し、ここで、（ａ）に示すのは適応進化菌体ＯＤ６００の変化状況であり、（ｂ）に示すのは適応進化ＲＮＡ含有量の変化状況である。図１から分かるように、菌体ＯＤ６００値及びＲＮＡ含有量は抑制物質の濃度が高くなるにつれて高くなる。 進化ライブラリーのハイスループットスクリーニング：ＳＹＴＯ （登録商標） ＲＮＡＳｅｌｅｃｔ（商標）を１００００倍希釈して５００ｎＭ染色液に調製し、１ｍＬを吸引し、上記進化した後に遠心分離して得られた菌体に加え、菌体を再懸濁し、３０℃、５０ｒｐｍで２０ｍｉｎ振とうインキュベートし、５０００ｒｐｍで５ｍ