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JP-2026514910-A - 酸化ストレス測定方法

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Abstract

細胞または組織試料中の酸化ストレスを測定する方法であって、（ｉ）培地中で細胞または組織試料を処理する工程と、（ｉｉ）培地の一部を収集する工程と、（ｉｉｉ）細胞または組織試料中の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）および酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の量を測定する工程と、（ｉｖ）工程（ｉｉ）で収集された培地部分中の活性酸素種（ＲＯＳ）の量を測定する工程と、を含み、工程（ｉｉｉ）が、工程（ｉ）および（ｉｉ）の直後に実施され、工程（ｉｖ）は工程（ｉｉｉ）と同時に実施されるか、または収集された培地部分が、工程（ｉｖ）が実施されるまで約４℃で保存される場合、アッセイ時間を含む工程（ｉｉｉ）の６時間以内に実施される、方法。 【選択図】図１

Inventors

  • オルテガ トーレス ロラ
  • ゴラルフチク アンナ グラジナ
  • マティアス ペレイラ ホルヘ アンドレ
  • ハガイェグ ジャフロミ ネダ

Assignees

  • フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム

Dates

Publication Date
20260513
Application Date
20240422
Priority Date
20230421

Claims (15)

  1. 細胞または組織試料における酸化ストレスを測定する方法であって、 （ｉ）培地中で細胞または組織試料を処理する工程と、 （ｉｉ）前記培地の一部分を収集する工程と、 （ｉｉｉ）前記細胞または組織試料中のグルタチオンの量を測定する工程と、 （ｉｖ）工程（ｉｉ）で収集された前記培地部分中の活性酸素種（ＲＯＳ）の量を測定する工程と、を含み、 工程（ｉｉｉ）は、工程（ｉ）および工程（ｉｉ）の直後に実施され、 工程（ｉｖ）は、工程（ｉｉｉ）と同時に実施されるか、または前記収集された培地部分が、工程（ｉｖ）が実施されるまで約０～８℃で保存される場合、アッセイ時間を含む工程（ｉｉｉ）の６時間以内に実施される、方法。
  2. 前記ＲＯＳ量および／またはグルタチオン量が発光を使用して測定され、好ましくは前記ＲＯＳ量および／またはグルタチオン量が定量的または定性的または相対的に測定される、請求項１に記載の方法。
  3. 工程（ｉ）の前記培地が、過酸化水素（Ｈ 2 Ｏ 2 ）基質、適切にはＲＯＳ－Ｇｌｏ（商標）Ｈ 2 Ｏ 2 基質を含む、請求項１～２のいずれかに記載の方法。
  4. 工程（ｉ）の前記処理期間が、約６時間以下である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 工程（ｉｉｉ）で測定したグルタチオンの前記量が、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）および酸化型ＧＳＨ（ＧＳＳＧ）の合計である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比が、工程（ｉｉｉ）で計算され、好ましくは、前記ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比が、相対発光量（ＲＬＵ）を使用して計算される、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 還元剤、好ましくはジスルフィド結合を還元することができる還元剤が、工程（ｉｉｉ）でＧＳＨ量を測定するために使用され、好ましくは、前記還元剤が、好ましくは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール、亜ジチオン酸塩、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素カリウム、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリフェニルホスフィン、またはトリブチルホスフィンである、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. 工程（ｉｉｉ）が、少なくとも以下の工程： （ａ）前記細胞または組織試料をウェルプレートに入れ、各ウェルにＧＳＨ－Ｇｌｏ（商標）試薬を添加し、室温で約３００ｒｐｍで約５分間振盪して、前記細胞を溶解する工程、 （ｂ）前記アッセイプレート中の標準曲線ウェルにＧＳＨ－Ｇｌｏ（商標）試薬を添加する工程、 （ｃ）ＧＳＨ－Ｇｌｏ（商標）試薬を還元剤および前記アッセイプレート中の一つまたは複数の前記水溶媒バックグラウンドコントロールウェルに添加し、前記試薬中にＤ－システインが存在しない場合、好ましくは０．０１～２０ｍＭ、好ましくは０．１～１０ｍＭを添加する工程、 （ｄ）前記溶解した細胞または組織試料を含む各ウェルを、前記アッセイプレート中の二つのウェルに分割する工程、 （ｅ）総グルタチオンを測定するために、各対の試料ウェルのうちの一つと、少なくとも一つの還元剤バックグラウンドコントロールウェルに前記還元剤を添加する工程、 （ｆ）還元型ＧＳＨを測定するために、前記還元剤を含有しない残りの試料ウェルと、一つまたは複数の水溶媒バックグラウンドコントロールウェルに水を添加する工程、 （ｇ）室温で約３００ｒｐｍで約１分間、すべてのウェルを振盪する工程、 （ｈ）すべてのウェルを室温でインキュベートする工程、 （ｉ）ルシフェリン－ルシフェラーゼ系からのシグナルを明らかにすることができる試薬を、前記試料ウェル、前記少なくとも一つの還元剤ウェル、および一つまたは複数の水溶媒バックグラウンドコントロールウェル、ならびに標準曲線ウェルに添加する工程、 （ｊ）室温で約３００ｒｐｍで約１分間、すべてのウェルを振盪する工程、 （ｋ）すべてのウェルを室温でインキュベートする工程、および （ｌ）発光を測定する工程、を含む、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記還元剤がジスルフィド結合を還元することができ、好ましくは前記還元剤がジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール、亜ジチオン酸塩、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素カリウム、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリフェニルホスフィン、またはトリブチルホスフィンである、請求項８に記載の方法。
  10. 工程（ｌ）が、発光プレートリーダーを使用して実施される、請求項８～９のいずれかに記載の方法。
  11. 工程（ｉｉｉ）が、少なくとも以下の工程： （Ａ）前記試料から細胞上清を除去する工程、 （Ｂ）受動的溶解緩衝液を試料に加え、約３００ｒｐｍで約５分間振盪する工程、 （Ｃ）前記試料を二つのウェル間で均等に分割する工程、 （Ｄ）一つのウェルにルシフェリン－ＮＴを添加し、総グルタチオンを定量する工程、 （Ｅ）ルシフェリン－ＮＴおよびＮ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）を他のウェルに添加し、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を定量する工程、 （Ｆ）両方のウェルを、室温で約３００ｒｐｍで振盪しながら約５分間インキュベートする工程、 （Ｇ）ルシフェリン生成試薬を各ウェルに添加する工程、約１分間振盪する工程、 （Ｈ）両方のウェルを室温でインキュベートする工程、 （Ｉ）両方のウェルにルシフェリン－ルシフェラーゼ系からの前記シグナルを明らかにすることができる試薬を添加し、約１分間振盪する工程、 （Ｊ）両方のウェルを約１４分間インキュベートする工程、 （Ｋ）試料ウェルを、較正曲線を含有するアッセイプレートに移す工程、および （Ｌ）発光を測定する工程、を含む、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  12. 工程（Ｌ）が、発光プレートリーダーを使用して実施される、請求項１１に記載の方法。
  13. 工程（ｉｖ）が、少なくとも以下の工程： （ｈ）培地のみの対照試料および等量の化合物干渉対照をアッセイプレートに添加する工程、 （ｉ）前記アッセイプレートの少なくとも約１０ウェルに標準曲線を加える工程、 （ｊ）すべてのウェルにルシフェリン－ルシフェラーゼ系からの前記シグナルを明らかにすることができる試薬を添加し、前記試薬中にＤ－システインがまだ存在しない場合、好ましくは０．０１～２０ｍＭ、好ましくは０．１～１０ｍＭを添加する工程、 （ｋ）アッセイプレートを、約３００ｒｐｍで室温で約１分間振盪する工程、 （ｌ）前記アッセイプレートをほぼ室温で約２０分間インキュベートする工程、 （ｍ）発光を測定する工程、を含む、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
  14. ＰｒｏｍｅｇａのＧＳＨ－Ｇｌｏ（商標）アッセイキットまたはＧＳＨ／ＧＳＳＧ－Ｇｌｏ（商標）キット、ならびに還元試薬および説明書を含むキット。
  15. ＰｒｏｍｅｇａのＲＯＳ－Ｇｌｏ（商標）Ｈ 2 Ｏ 2 アッセイをさらに含む、請求項１４に記載のキット。

Description

本発明は、細胞または組織における酸化ストレスを測定する方法に関する。特に、還元型および酸化型グルタチオンの量、ならびに活性酸素種の量が、同じ時点で同じ細胞または組織試料中で測定される方法が記載される。 酸化ストレスは、環境要因に対する毒性の一般的な特徴であり、一方で内因性細胞プロセスの基礎でもある。酸化ストレスは、酸化種、特に活性酸素種（ＲＯＳ）の過剰産生速度から生じる生物学的システムにおける酸化還元不均衡として説明することができ、これは酸化するとグルタチオン二硫酸塩（ＧＳＳＧ）になる、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を含む、抗酸化防御によって相殺されない。この差異は、細胞および細胞系に損傷を引き起こす可能性がある（Ｖｏｎａ Ｒ，ｅｔ．ａｌ．，Ｔｈｅ Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０２１ Ｊａｎ ３０；１０（２）：２０１．ｄｏｉ：１０．３３９０／ａｎｔｉｏｘ１００２０２０１．ＰＭＩＤ：３３５７３２２２；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ７９１０８７８）および酸化ストレスは、多くのヒト疾患の病因および進行において重要な役割を果たしていることが示されている（Ｆｏｒｍａｎ ＨＪ，Ｚｈａｎｇ Ｈ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ：ｐｒｏｍｉｓｅ ａｎｄ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２０２１ Ｓｅｐ；２０（９）：６８９－７０９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５７３－０２１－００２３３－１．Ｅｐｕｂ ２０２１ Ｊｕｎ ３０．Ｅｒｒａｔｕｍ ｉｎ：Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２０２１ Ａｕｇ；２０（８）：６５２．ＰＭＩＤ：３４１９４０１２；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ８２４３０６２．）。 酸化ストレスのほとんどの研究は、その科学的に認められた定義によれば、ＲＯＳまたはグルタチオン（ＧＳＨおよび／またはＧＳＳＧ）のいずれかの量を評価するのみで、同じ時点で同じ生物学的試料中の両方のバイオマーカーを評価していないため、この細胞プロセスの特徴付けが不完全である。文献で入手可能な酸化ストレス関連データの妥当性は、異なる生物学的試料の使用、変動する時点、および応答の時間的分解能の低さによる精度の欠如のため、しばしば議論の余地がある（例えば、Ｓｉｅｓ Ｈ，ｅｔ．ａｌ．，Ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ（ＲＯＳ）ｉｎ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０２２ Ｊｕｌ；２３（７）：４９９－５１５ ＰＭＩＤ：３５１９０７２２ ａｎｄ ｆｏｒ ａ ｓｕｍｍａｒｙ Ｆｒｉｊｈｏｆｆ Ｊ，ｅｔ．ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｓｓ．Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．２０１５ Ｎｏｖ １０；２３（１４）：１１４４－４０．ＰＭＩＤ：２６４１５１４３）。 酸化ストレスを判定するほとんどの利用可能な方法は、スループット能力が低く、試験化合物による干渉に敏感であるため、３Ｄ組織モデルやスクリーニングなどのハイスループット評価活動には適していない。 本発明は、ＲＯＳおよびグルタチオン（ＧＳＨおよびＧＳＳＧ）の両方の量が、同じ組織内および同じ時点で正確に測定され得る、酸化ストレスを測定するための改善された方法を提供することを目的としている。 本発明者らは、生物発光に基づく試験を最適化することによって、細胞または組織試料における酸化ストレスを測定する方法を開発した。予想外なことに、同じ試料で、二つの異なる試験を同時に実現することが可能であることが見出された。すなわち、酸化ストレスの包括的かつ生物学的に関連する特徴付けのために、同じエンドポイントに対して二つの試験を実施する。 第一に、発明者らは、ルシフェリン－ＮＴ基質およびグルタチオンＳ－トランスフェラーゼを利用するアッセイ（例えば、ＧＳＨ－Ｇｌｏ（商標）アッセイ）を改善した。具体的には、公知のプロトコルの一部ではない追加の工程を含め、ジスルフィド結合を還元できる還元試薬（例えば、Ｍｏｎｏｓｔｏｒｉ Ｐ，Ｗｉｔｔｍａｎｎ Ｇ，Ｋａｒｇ Ｅ，Ｔｕｒｉ Ｓ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ａｎｄ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ：ａｎ ｉｎ－ｄｅｐｔｈ ｒｅｖｉｅｗ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ２００９；８７７：３３３１－４６．１０．１０１６／ｊ．ｊｃｈｒｏｍｂ．２００９．０６．０１６に記載するように、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール、亜ジチオン酸塩、水素化ホウ素ナトリウムおよびカリウム、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリフェニルホスフィン、およびトリブチルホスフィンなど）を使用して、同じ試料中のＧＳＨ（還元型）だけでなく、総グルタチオンおよびＧＳＳＧ（酸化型）の定量も行うことで、このようなアッセイを改善した。この最適化は、細胞酸化還元状態および関連する酸化ストレスバイオマーカーの有益な指標であるＧＳＨ／ＧＳＳＧ比の計算を可能にした。ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比評価のための代替キット（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ ＧＳＨ／ＧＳＳＧ－Ｇｌｏ（商標））が存在するが、本明細書に記載の改善された方法は、同じ生物学的試料からＧＳＨ（還元型）およびＧＳＳＧ（酸化型）を評価することによって、より関連性のある比の測定を提供し、試料要件の観点から５０％のコスト削減という追加の利益をもたらす。 第二に、発明者らは、別の酸化ストレスバイオマーカーＲＯＳの評価を用いて、ＧＳＨ／ＧＳＳＧアッセイをさらに補完した。これは、グルタチオンアッセイと同じ試料上で使用することができ、したがって、特定の時点で得られる細胞または組織試料の酸化ストレスをより包括的に把握できるようになる。本明細書で使用される場合、「バイオマーカー」という用語は、特定の生理学的プロセス、特に病理学的プロセスを特定することができる分子、遺伝子、または特性を指す。 本発明は、複数の酸化ストレスバイオマーカーの測定を、時間経過にわたって（例えば、細胞もしくは組織試料に対して酸化ストレスが生じる期間にわたって、またはある時点で細胞を採取する個体に対して）測定することを可能にする。この文脈においては、生物学的現象の動的かつ一過性の性質のために、時間経過が重要である（Ｌｕｓｈｃｈａｋ Ｕｋｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２０１５；Ｖｏｌｕｍｅ ８７，Ｉｓｓｕｅ ６，Ｎｏｖ－Ｄｅｃ，ｐｐ．１１－１８）。 第一の態様では、細胞または組織試料中の酸化ストレスを測定する方法であって、（ｉ）培養培地中で細胞または組織試料を処理する工程と、（ｉｉ）培地の一部を収集する工程と、（ｉｉｉ）細胞または組織試料中のグルタチオン（ＧＳＨ、ＧＳＳＧおよび総量）の量を測定する工程と、（ｉｖ）工程（ｉｉ）で収集された培地部分中の活性酸素種（ＲＯＳ）の量を測定する工程とを含み、工程（ｉｉｉ）が、工程（ｉ）および（ｉｉ）の直後に実施され、工程（ｉｖ）は工程（ｉｉｉ）と同時に実施されるか、または収集された培地部分が、工程（ｉｖ）が実施されるまで０～８℃、好ましくは、２～６℃、最も好ましくは、約４℃で保存される場合、アッセイ時間を含む工程（ｉｉｉ）の６時間以内に実施される、方法が記載される。 ＲＯＳ量および／またはグルタチオン量は、発光を使用して測定されることが適切である。 ＲＯＳ量および／またはグルタチオン量は、定量的または定性的または相対的に測定されることが適切である。 本方法の工程（ｉ）の培地は、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）基質、最も適切にはＲＯＳ－Ｇｌｏ（商標）Ｈ2Ｏ2基質を含むのが適切である。 本方法の工程（ｉ）における処理期間は、６時間以下であるのが適切である。 本方法の工程（ｉｉｉ）で測定されたグルタチオンの量は、ＧＳＨ（還元型）とＧＳＳＧ（酸化型）との合計であるのが適切である。 工程（ｉｉｉ）で測定されたグルタチオンの量は、２つのＧＳＨ（還元型）分子が単一のＧＳＳＧ（酸化型）分子に酸化され、逆に単一のＧＳＳＧ分子が二つのＧＳＨ分子に還元される、グルタチオン酸化還元サイクルの化学量論を考慮に入れることが適切である。 ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比は、本方法の工程（ｉｉｉ）で計算することが適切である。 ＧＳＨ／ＧＳＳＧ比は、相対発光量（ＲＬＵ）またはグルタチオン標準曲線からのグルタチオンモル濃度を使用して計算することが適切である。 好適には、還元剤、好適にはジスルフィド結合を還元することができる還元剤を使用して、本方法の工程（ｉｉｉ）において総グルタチオン量を測定している。 さらなる態様では、本方法の工程（ｉｉｉ）は、少なくとも以下の工程： （ａ）細胞または組織試料をウェルプレートに入れ、各ウェルにＧＳＨ－Ｇｌｏ（商標）試薬を添加し、室温で約５０～３５０ｒｐｍ、好ましくは約３００ｒｐｍで約２～１０分間、好ましくはで約５分間振盪して、細胞を溶解する工程、 （ｂ）アッセイプレート中の標準曲線ウェルにＧＳＨ－Ｇｌｏ（商標）試薬を添加する工程、 （ｃ）ＧＳＨ－Ｇｌｏ（商標）試薬を還元剤とアッセイプレート中の一つまたは複数の水溶媒バックグラウンドコントロールウェルに添加する工程、 （ｄ）溶解した細胞または組織試料を含む各ウェルを、アッセイプレート中の二つのウェルに分割する工程、 （ｅ）総ＧＳＨを測定するために、試料ウェルの各対のうちの一つと、少なくとも一つの還元剤バックグラウンドコントロールウェルに還元剤を添加する工程、 （ｆ）還元型ＧＳＨを測定するために、還元剤を含有しない残りの試料ウェルと、一つまたは複数の水溶媒バックグラウンドコントロールウェルに水を添加する工程、 （ｇ）室温で約３００ｒｐｍで約１分間、すべてのウェルを振盪する工程、 （ｈ）すべてのウェルを室温でインキュベートする工程、 （ｉ）ルシフェリン－ルシフェラーゼ系からのシグナルを明らかにすることができる試薬を、試料ウェル、少なくとも一つの還元剤ウェル、および一つまたは複数の水溶媒バックグラウンドコントロールウェル、ならびに標準曲線ウェルに添加する工程、 （ｊ）室温で約３００ｒｐｍで約１分間、すべてのウェルを振盪する工程、 （ｋ）すべてのウェルを室温でインキュベートする工程、および （ｌ）発光を測定する工程、を含む。 好適には、ジスルフィド結合を還元することができる還元剤、好適には、還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール、亜ジチオン酸塩、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素カリウム、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリフェニルホスフィン、またはトリブチルホスフィン、例えば、ＴＣＥＰ Ｂｏｎｄ ｂｒｅａｋｅｒ（商標）トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である。 好適には、工程（ｌ）は、発光プレートリーダーを使用して実施される。 さらなる態様では、本方法の工程（ｉｉｉ）は、少なくとも以下の工程： （Ａ）試料から細胞上清を除去する工程、 （Ｂ）受動的溶解緩衝液を試料に加え、約５０～３５０ｒｐｍ、好ましくは約３００ｒｐｍで、約