JP-2026514922-A - ポリメラーゼバリアント

JP2026514922AJP 2026514922 AJP2026514922 AJP 2026514922AJP-2026514922-A

Abstract

本明細書では、酵素ポリペプチドと、バリアントアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を有するライブラリーとに関する、方法および組成物が記載される。さらに、本明細書では、バリアントアミノ酸配列を有する酵素ポリペプチドを使用してポリヌクレオチド分子を伸長する方法が記載される。さらに、本明細書では、バリアントアミノ酸配列を有するポリメラーゼポリペプチドを使用してシーケンシングライブラリーを調製するための方法が記載される。【選択図】図１

Inventors

スミス，オーウェンカブニック
タイ，ショーンパトリック
リ，シュエンユーエリアン
ゼイトゥーン，ラムジーイブラヒム
チェン，スーユエン

Assignees

ツイストバイオサイエンスコーポレーション

Dates

Publication Date: 20260513
Application Date: 20240417
Priority Date: 20230421

Claims (20)

配列番号１に対して少なくとも１つのアミノ酸変異を含むアミノ酸配列を含むポリペプチド。
配列番号３～９のいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％相同であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
前記アミノ酸変異が、付加、欠失、置換、またはそれらの組合せを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
前記欠失が、配列番号１に対してＮ末端から２５０～３００個のアミノ酸を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
配列番号１に対して少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのアミノ酸変異を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
前記アミノ酸変異が、配列番号１に対して位置Ｖ４４９、Ｖ４９３、Ｌ５２２、Ｌ６０５、Ｔ６６４、Ｅ６８１、Ｗ７０６、Ｄ７３２、Ｒ７３６、Ｒ７３６、およびＧ８２４のうちの１つ以上にある、請求項１に記載のポリペプチド。
前記アミノ酸変異が、配列番号１に対して、Ｖ４４９Ｆ、Ｖ４９３Ｌ、Ｌ５２２Ｉ、Ｌ６０５Ｃ、Ｔ６６４Ｉ、Ｅ６８１Ｇ、Ｗ７０６Ｙ、Ｄ７３２Ａ、Ｒ７３６Ｋ、Ｒ７３６Ｑ、およびＧ８２４Ａのうちの１つ以上から選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
精製タグをさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
請求項９に記載の核酸を含むベクター。
請求項９に記載の核酸分子を含む細胞。
第１のポリヌクレオチドを伸長する方法であって、前記第１のポリヌクレオチドをヌクレオチドおよびポリペプチドと接触させて、伸長ポリヌクレオチドを形成する工程を含み、前記ポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも１つのアミノ酸変異を含むアミノ酸配列を含む、方法。
前記第１のポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡもしくはその断片、ｃＤＮＡ、またはアデノシン三リン酸を含む、請求項１２に記載の方法。
単一ヌクレオチドの組み込みに対して少なくとも９０％選択的である、請求項１２に記載の方法。
ヌクレオチド型の組み込みに対して少なくとも９０％選択的である、請求項１２に記載の方法。
グアニン（Ｇ）よりもアデニン（Ａ）に対して少なくとも９５％選択的である、請求項１５に記載の方法。
前記伸長ポリヌクレオチドにアダプターをライゲーションする工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記アダプターが、前記伸長ポリヌクレオチドに対する相補的オーバーハングを含む、請求項１７に記載の方法。
第２のポリヌクレオチドを伸長する工程をさらに含み、前記第１のポリヌクレオチドと前記第２のポリヌクレオチドとがハイブリダイズされる、請求項１７に記載の方法。
シーケンシングライブラリーを調製するための方法であって、複数の核酸を提供する工程と、前記複数の核酸を末端修復する工程と、ポリメラーゼを使用して、前記複数の核酸に対してａテーリングを行う工程であって、前記ポリメラーゼは、配列番号１に対して少なくとも１つのアミノ酸変異を含むアミノ酸配列を含む、工程と、リガーゼを使用して、少なくとも１つのアダプターを前記核酸にライゲーションする工程とを含む、方法。

Description

関連出願への相互参照本出願は、２０２３年４月２１日出願の米国仮特許出願第６３／４９７，６６５号の優先権を主張するものであり、その全体は参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書で言及される刊行物、特許、および特許出願はすべて、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願がそれぞれ参照により組み込まれるように、具体的かつ個々に指示されるのと同じ程度にまで、参照により本明細書に組み込まれる。酵素は、シーケンシング用途の化学生物学において使用されるものを含む幅広い化学反応を触媒する能力がある。しかし、酵素の設計および実装は困難であり得る。従って、酵素の特性の最適化のための組成物および方法を開発するニーズがある。本明細書では、配列番号１に対して少なくとも１つのアミノ酸変異を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号３～９のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％相同である。いくつかの実施形態では、変異は、付加、欠失、置換、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、欠失は、配列番号１に対して、Ｎ末端から２５０～３００個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのアミノ酸変異を含む。いくつかの実施形態では、変異は、配列番号１に対して位置Ｖ４４９、Ｖ４９３、Ｌ５２２、Ｌ６０５、Ｔ６６４、Ｅ６８１、Ｗ７０６、Ｄ７３２、Ｒ７３６、Ｒ７３６、およびＧ８２４のうちの１つ以上にある。いくつかの実施形態では、変異は、配列番号１に対して、Ｖ４４９Ｆ、Ｖ４９３Ｌ、Ｌ５２２Ｉ、Ｌ６０５Ｃ、Ｔ６６４Ｉ、Ｅ６８１Ｇ、Ｗ７０６Ｙ、Ｄ７３２Ａ、Ｒ７３６Ｋ、Ｒ７３６Ｑ、およびＧ８２４Ａのうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、精製タグを含む。また、本明細書では、ポリペプチドをコードする核酸分子、ならびに核酸分子を含むベクターおよび細胞が提供される。本明細書では、第１のポリヌクレオチドを伸長するための方法が提供される。いくつかの態様では、方法は、第１のポリヌクレオチドをヌクレオチドおよびポリペプチドと接触させて伸長ポリヌクレオチドを形成する工程を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも１つのアミノ酸変異を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡもしくはその断片、ｃＤＮＡ、またはアデノシン三リン酸を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、単一ヌクレオチドの組み込みに対して少なくとも９０％選択的である。いくつかの実施形態では、方法は、ヌクレオチド型の組み込みに対して少なくとも９０％選択的である。いくつかの実施形態では、本方法は、グアニン（Ｇ）よりも、アデニン（Ａ）に少なくとも９５％選択的である。いくつかの実施形態では、方法は、アダプターを伸長ポリヌクレオチドにライゲーションする工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、アダプターは、伸長ポリヌクレオチドに対する相補的オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、方法は、第２のポリヌクレオチドを伸長させる工程をさらに含む。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとはハイブリダイズされる。本明細書では、シーケンシングライブラリーを調製するための方法が提供される。いくつかの態様では、方法は、複数の核酸を提供する工程と、複数の核酸を末端修復する工程と、ポリメラーゼを使用して、複数の核酸に対してａテーリング（ａ－ｔａｉｌｉｎｇ）を行う工程と、リガーゼを使用して、少なくとも１つのアダプターを核酸にライゲーションする工程とを含む。いくつかの態様では、ポリメラーゼは、配列番号１に対して少なくとも１つのアミノ酸変異を含むアミノ酸配列を含む。図１は、本開示の態様による、ＴａｑＩＴＤＮＡポリメラーゼ（「ＴａｑＩＴ」）のバリアントのＡテーリング活性（Ａ－ｔａｉｌｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙ）をアッセイするための例示的なワークフローを示す図である。図２Ａ～２Ｄは、本開示の態様による、末端修復およびＡテーリングの前後の例示的なアダプターの末端組成を示す棒グラフである。図２Ａは、平滑末端または長さが異なるオーバーハングを有する未処理の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）分子のリードカウントを示す。図２Ａ～２Ｄは、本開示の態様による、末端修復およびＡテーリングの前後の例示的なアダプターの末端組成を示す棒グラフである。図２Ｂは、平滑末端または長さが異なるオーバーハングを有する末端修復されたｃｆＤＮＡ分子のリードカウントを示す。図２Ａ～２Ｄは、本開示の態様による、末端修復およびＡテーリングの前後の例示的なアダプターの末端組成を示す棒グラフである。図２Ｃは、平滑末端または長さが異なるオーバーハングを有する末端修復およびＡテーリングされたｃｆＤＮＡ分子のリードカウントを示す。図２Ａ～２Ｄは、本開示の態様による、末端修復およびＡテーリングの前後の例示的なアダプターの末端組成を示す棒グラフである。図２Ｄは、野生型ＴａｑＩＴＤＮＡポリメラーゼによって付加された３’オーバーハングを有する１塩基対の末端組成を示す。図３は、本開示の態様による、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼにおける位置（左から右：７３０～７５５）に対するアミノ酸の累積確率（０．２単位間隔で０．０～１．０）を示す確率プロットである。図４Ａは、本開示の態様による、ＤＮＡポリメラーゼのＡテーリングバリアントの例示的な第１ラウンドスクリーニングからの平均の正規化された結果を示す散布図である。図４Ｂは、本開示の態様による、野生型ＤＮＡポリメラーゼに対して高活性のバリアントの倍数変化値を示す表である。図５Ａ～５Ｃは、本開示の態様による、ｎ個のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ相同体を野生型と比較する例示的な実験の結果を示す。図５Ａは、２つの精製された野生型ＤＮＡポリメラーゼのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの写真である。図５Ａ～５Ｃは、本開示の態様による、ｎ個のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ相同体を野生型と比較する例示的な実験の結果を示す。図５Ｂは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの１２の精製された相同体のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの写真である。図５Ａ～５Ｃは、本開示の態様による、ｎ個のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ相同体を野生型と比較する例示的な実験の結果を示す。図５Ａ～５Ｃは、本開示の態様による、ｎ個のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ相同体を野生型と比較する例示的な実験の結果を示す。図５Ｃは、１２のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ相同体および２の野生型ＤＮＡポリメラーゼのそれぞれを用いて実施した次世代シーケンシングの結果を示す棒グラフである。図６Ａ～６Ｃは、本開示の態様による、ＴａｑＩＴＤＮＡポリメラーゼのバイナリー（ｂｉｎａｒｙ、二つ組）Ａテーリングバリアントを野生型と比較する、例示的な実験の結果を示す。図６Ａは、ＴａｑＩＴＤＮＡポリメラーゼの例示的なバイナリーＡテーリングバリアントからの正規化された結果を示す散布図である。図６Ａ～６Ｃは、本開示の態様による、ＴａｑＩＴＤＮＡポリメラーゼのバイナリーＡテーリングバリアントを野生型と比較する、例示的な実験の結果を示す。図６Ｂは、野生型に対して高活性のバイナリーバリアントの倍数変化値を示す表である。図６Ａ～６Ｃは、本開示の態様による、ＴａｑＩＴＤＮＡポリメラーゼのバイナリーＡテーリングバリアントを野生型と比較する、例示的な実験の結果を示す。図６Ｃは、ＴａｑＩＴＤＮＡポリメラーゼのバイナリーＡテーリングバリアントからのさらなる結果を示す散布図である。図７Ａ～７Ｃは、本開示の態様による、ＴａｑＩＴＤＮＡポリメラーゼのバイナリーバリアントを評価する例示的な実験の結果を示す。図７Ａは、ＴａｑＩＴＤＮＡポリメラーゼの精製バイナリーバリアントのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの写真である。図７Ａ～７Ｃは、本開示の態様による、ＴａｑＩＴＤＮＡポリメラーゼのバイナリーバリアントを評価する例示的な実験の結果を示す。図７Ｂは、野生型と比較した、バイナリーバリアントを用いて行った次世代シーケンシングからの結果を示す棒グラフである。図７Ａ～７Ｃは、本開示の態様による、ＴａｑＩＴＤＮＡポリメラーゼのバイナリーバリアントを評価する例示的な実験の結果を示す。図７Ｃは、さらなるバイナリーバリアントの次世代シーケンシングの結果を示す棒グラフである。図８Ａ～８Ｂは、本開示の態様による、ＴａｑＩＴＤＮＡポリメラーゼのバイナリーＡテーリングバリアントの有効性を評価する例示的な実験の結果を示す。図８Ａは、バイナリーバリアントによるＡテーリング後の正しいテール長を有するリード割合を示す棒グラフである。図８Ａ～８Ｂは、本開示の態様による、ＴａｑＩＴＤＮＡポリメラーゼのバイナリーＡテーリングバリアントの有効性を評価する例示的な実験の結果を示す。図８Ｂは、アデノシン（Ａ）付加の代わりにグアニン（Ｇ）を有する単一塩基対３’オーバーハングのリード割合を示す棒グラフである。図９Ａ～９Ｂは、本開示の態様による、ＴａｑＩＴＤＮＡポリメラーゼのターシャリーバリアント（ｔｅｒｔｉａｒｙｖａｒｉａｎｔ）を評価する例示的な実験の結果を示す。図９Ａは、ターシャリーバリアントからの正規化された結果を示す散布図である。図９Ａ～９Ｂは、本開示の態様による、ＴａｑＩＴＤＮＡポリメラーゼのーシャリーバリアントを評価する例示的な実験の結果を示す。図９Ｂは、野生型に対して高活性のターシャリーバリアントの倍数変化値を示す表である。本開示は、別段の指示がない限り、当技術分野の技術の範囲内である従来の分子生物学技術を使用する。別様に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書では、シーケンシングライブラリーを生成するための組成物および方法が提供される。さらに、本明細書では、ライブラリーの生成を改善するための操作された酵素が提供される。さらに、本明細書では、シーケンシングライブラリーを生成するためのポリメラーゼが提供される。定義本開示の全体にわたり、様々な実施形態が、範囲形式で提示される。範囲形式での記載は利便性と簡潔さのみを目的とするものであり、任意の実施形態の範囲に対する確固たる限定として解釈するべきではないことを理解されたい。従って、範囲の記載は、全ての可能なサブ範囲、同様に、文脈が明確に指示していない限り下限の単位の１０分の１まで、その範囲内の個々の数値を具体的に開示したものと考慮されねばならない。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの下位範囲と、その範囲内の個々の数値、例えば１．１、２、２．３、５、５．９を具体的に開示したものと考慮する必要がある。このことは範囲の広さに関係なく適用される。このような介入する範囲の上限と下限は、より小さな範囲内に独立して含まれてもよく、更に、定められた範囲内の任意の具体的に除外された限度に従って本開示の内に包含される。述べられた範囲が限界の１つまたは両方を含む場合、そのような含まれた限界の何れかまたは両方を除いた範囲も、文脈が明確に指示していない限り本開示に含まれる。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載するためのものであり、何れの実施形態も制限するようには意図されていない。本明細書では、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、前後関係から明らかでない限り、同様に複数形を含むことを意図している。本明細書では、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および／または「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎ