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JP-2026515013-A - 操作されたＴＥＴ酵素及びＴｅｔ補助ピリジンボランシーケンシング（ＴＡＰＳ）などのエピジェネティクス及び次世代シーケンシング（ＮＧＳ）における使用

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Abstract

本発明は、エピジェネティクス及び次世代シーケンシング（ＮＧＳ）において利用される操作されたＴＥＴ酵素、及び、より具体的には、Ｔｅｔ補助ピリジンボランシーケンシング（ＴＡＰＳ）などのシーケンシング法に関する。 【選択図】なし

Inventors

  • バージェス－ブラウン ニコラ エイ
  • ヒンクス ジョン
  • トルトリチ マルチェッロ
  • ダゴスティーノ ロサ
  • フェルナンデス－シド アレハンドラ

Assignees

  • エグザクト サイエンシズ イノヴェーション リミテッド

Dates

Publication Date
20260513
Application Date
20240424
Priority Date
20230428

Claims (20)

  1. 操作された１０－１１トランスロカーゼ（ＴＥＴ）酵素であって、以下からなる群から選択される少なくとも１つの置換変異を含むＴＥＴ触媒ドメインを含み、 －前記触媒ドメインにおける非システインアミノ酸の、システインによる置換、 －前記触媒ドメインにおけるシステインの、非システインアミノ酸による置換、及び －それらの組み合わせ、 前記操作されたＴＥＴ酵素は、５－メチルシトシン（５ｍＣ）から５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）へ、及び／または５ｈｍＣから５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）及び／または５－カルボキシシトシン（５ｃａＣ）への酸化を触媒する、前記操作されたＴＥＴ酵素。
  2. システインで置換される前記少なくとも１つの非システインアミノ酸が、前記ＴＥＴ酵素のアイソフォームまたはオルソログにおいてシステインによって占有される前記ＴＥＴ酵素の前記触媒ドメイン内の位置で生じる、請求項１に記載の操作されたＴＥＴ酵素。
  3. 前記ＴＥＴ触媒ドメインが、マウスＴＥＴ２触媒ドメインであり、前記アイソフォームが、マウスＴＥＴ１である、請求項２に記載の操作されたＴＥＴ酵素。
  4. システインで置換される前記少なくとも１つの非システインアミノ酸が、１２８６、１２９１、１３２２、１８３５、及び１８３７、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される位置にあり、前記位置番号は、完全長マウスＴＥＴ２の位置番号に基づく、請求項３に記載の操作されたＴＥＴ酵素。
  5. 前記置換が、Ａ１２８６Ｃ、Ｓ１２９１Ｃ、Ｋ１３３２Ｃ、Ｍ１８３５Ｃ及びＥ１８３７Ｃの置換、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択され、前記位置番号は、完全長マウスＴＥＴ２の位置番号に基づく、請求項４に記載の操作されたＴＥＴ酵素。
  6. 非システインアミノ酸で置換される前記触媒ドメイン内の前記少なくとも１つのシステインが、前記ＴＥＴ酵素のアイソフォームにおいて非システインによって占有される前記ＴＥＴ酵素の前記触媒ドメイン内の位置で生じる、請求項１～５のいずれか１項に記載の操作されたＴＥＴ酵素。
  7. 前記ＴＥＴ触媒ドメインが、マウスＴＥＴ２触媒ドメインであり、前記アイソフォームが、マウスＴＥＴ１酵素である、請求項６に記載の操作されたＴＥＴ酵素。
  8. 非システインアミノ酸で置換される前記少なくとも１つのシステインが、１１６８、１１７１、１１８５、１２７２、１７７２、１７９２及び１８２７、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される位置にあり、前記位置番号は、完全長マウスＴＥＴ２の位置番号に基づく、請求項７に記載の操作されたＴＥＴ酵素。
  9. 前記置換が、Ｃ１１６８Ｙ、Ｃ１１７１Ｐ、Ｃ１１８５Ｔ、Ｃ１２７２Ｒ、Ｃ１７７２Ｓ、Ｃ１７９２Ｋ及びＣ１８２７Ｇの置換、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択され、前記位置番号は、完全長マウスＴＥＴ２の位置番号に基づく、請求項８に記載の操作されたＴＥＴ酵素。
  10. 前記操作されたＴＥＴ酵素の前記触媒ドメインが、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を共有するＮ末端部分及び配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を共有するＣ末端部分を有し、ただし、前記触媒ドメインが、Ａ１２８６Ｃ、Ｓ１２９１Ｃ、Ｋ１３３２Ｃ、Ｍ１８３５Ｃ、Ｅ１８３７Ｃ、Ｃ１１６８Ｙ、Ｃ１１７１Ｐ、Ｃ１１８５Ｔ、Ｃ１２７２Ｒ、Ｃ１７７２Ｓ、Ｃ１７９２Ｋ及びＣ１８２７Ｇの置換、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含み、前記位置番号は、完全長マウスＴＥＴ２の位置番号に基づく、請求項１～９のいずれか１項に記載の操作されたＴＥＴ酵素。
  11. 前記触媒ドメインの前記Ｎ末端部分が、配列番号１に対応し、前記触媒ドメインの前記Ｃ末端部分が、配列番号２に対応する、請求項１０に記載の操作されたＴＥＴ酵素。
  12. 前記触媒ドメインの前記Ｎ末端部分及び前記触媒ドメインの前記Ｃ末端部分が、異種リンカー配列によって接続されている、請求項１０～１１のいずれか１項に記載の操作されたＴＥＴ酵素。
  13. 前記ＴＥＴ触媒ドメインが、マウスＴＥＴ３触媒ドメインであり、前記アイソフォームが、マウスＴＥＴ１である、請求項２に記載の操作されたＴＥＴ酵素。
  14. システインで置換される前記少なくとも１つの非システインアミノ酸が、１０７６、１１１２、１７２１、及び１７２６、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される位置にあり、前記位置番号は、完全長マウスＴＥＴ３の位置番号に基づく、請求項１３に記載の操作されたＴＥＴ酵素。
  15. 前記置換が、Ａ１０７６Ｃ、Ｉ１１１２Ｃ、Ｍ１７２１Ｃ、及びＥ１７２６Ｃの置換、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択され、前記位置番号は、完全長マウスＴＥＴ３の位置番号に基づく、請求項１４に記載の操作されたＴＥＴ酵素。
  16. さらに、９７５、１６５８、及び１６７８、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される位置のアミノ酸置換を含み、前記位置番号は、完全長マウスＴＥＴ３の位置番号に基づく、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の操作されたＴＥＴ酵素。
  17. 前記置換が、Ａ９７５Ｔ、Ｎ１６５８Ｓ、及びＲ１６７８Ｋの置換、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択され、前記位置番号は、完全長マウスＴＥＴ３の位置番号に基づく、請求項１６に記載の操作されたＴＥＴ酵素。
  18. 前記操作されたＴＥＴ酵素の前記触媒ドメインが、配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を共有するＮ末端部分及び配列番号４と少なくとも８０％の配列同一性を共有するＣ末端部分を有し、ただし、前記触媒ドメインが、Ａ１０７６Ｃ、Ｉ１１１２Ｃ、Ｍ１７２１Ｃ、Ｅ１７２６Ｃ、Ａ９７５Ｔ、Ｎ１６５８Ｓ、及びＲ１６７８Ｋの置換、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含み、前記位置番号は、完全長マウスＴＥＴ３の位置番号に基づく、請求項１３～１７のいずれか１項に記載の操作されたＴＥＴ酵素。
  19. 前記触媒ドメインの前記Ｎ末端部分が、配列番号３に対応し、前記触媒ドメインの前記Ｃ末端部分が、配列番号４に対応する、請求項１８に記載の操作されたＴＥＴ酵素。
  20. 前記触媒ドメインの前記Ｎ末端部分及び前記触媒ドメインの前記Ｃ末端部分が、異種リンカー配列によって接続されている、請求項１８～１９のいずれか１項に記載の操作されたＴＥＴ酵素。

Description

関連出願に関する記述 本出願は、２０２３年４月２８日に提出された米国仮出願第６３／４９８，８７４号の利益を主張し、この内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。 配列表 ２０２４年４月２４日に作成され、ファイルサイズが５９，１３５バイトであり、「４１７４４－６０１＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ」という名称の、本明細書と共に提出されたコンピュータで読み取り可能な配列表のテキストは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。 本発明は、エピジェネティクス及び次世代シーケンシング（ＮＧＳ）において利用される操作されたＴＥＴ酵素、より具体的には、Ｔｅｔ補助ピリジンボランシーケンシング（ＴＡＰＳ）などのシーケンシング法に関する。 多細胞生物の細胞は、遺伝的には均一であるが、遺伝子の発現の差異により、構造的及び機能的には不均一である。エピジェネティクスは、基礎となるＤＮＡ配列の変化を伴わない、遺伝子発現の可逆的で遺伝性の変化に関する研究である。エピジェネティクスのメカニズムは、数ある手段の中でも、ＤＮＡのメチル化などのＤＮＡの化学修飾によって媒介される。哺乳動物において、エピジェネティックな調節は、発生、細胞分化、及び増殖等の様々な異なるプロセスに重要である。状況に固有の遺伝子発現プログラム及び細胞表現型の根底にある調節ネットワーク及びエピジェネティクスのメカニズムを完全に理解することは、ヒトの健康に広く影響を与える重要な科学的目標として残されている。 上述したようなＤＮＡ配列のメチル化状態を決定できる方法は、最近まで、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）とバイサルファイトシーケンシング（ＢＳ）との組み合わせによってその必要性が満たされていた。Ｔｅｔ補助ピリジンボランシーケンシング（ＴＡＰＳ）の発明は、特にＤＮＡ試料の損傷及び感度に関して、ＢＳタイプの技法の多くの制限を克服する。感度は、試料ＤＮＡの力価が低いがん診断などのヘルスケア用途の開発にとって非常に重要である。特定の例としては、血液中の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の検出が挙げられるであろう。 ある特定のＴＡＰＳプロトコルは、１０－１１トランスロカーゼ（ＴＥＴ）酵素を利用する。ＴＥＴ酵素ファミリーは、５－メチルシトシン（５ｍＣ）を酸化させ、ＤＮＡメチル化の遺伝子座特異的な逆転を促進する。シトシンのメチル化は、真核生物における多く見られるエピジェネティック修飾であり、５－メチルシトシン（５ｍＣ）は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（Ｄｎｍｔ）活性によって生成され、染色体ＤＮＡのＣＧジヌクレオチド（ＣｐＧ）上に位置する。ＴＥＴタンパク質は、５ｍＣを５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）、５－ホルミルシトシン（５ｆｍＣ）、及び５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）に酸化させ、ＤＮＡのメチル化パターンを修飾する。 メチル化されたＤＮＡの酵素的変換のためのＴＥＴを用いる技術の信頼性から、ＴＥＴ酵素は大きな商業的及び医学的重要性を有する。 当技術分野では、大量生産、低コストの生産に適しており、非常に高感度のメチル化アッセイ用途に不可欠な高性能の機能特性も示す、改善された操作型のＴＥＴ酵素が必要とされている。 本発明は、エピジェネティクス及び次世代シーケンシング（ＮＧＳ）において利用される操作されたＴＥＴ酵素、及び、より具体的には、Ｔｅｔ補助ピリジンボランシーケンシング（ＴＡＰＳ）などのシーケンシング法に関する。 したがって、いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、触媒ドメインにおける非システインアミノ酸のシステインによる置換、触媒ドメインにおけるシステインの非システインアミノ酸による置換、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの置換変異を含むＴＥＴ触媒ドメインを含む、操作された１０－１１トランスロカーゼ（ＴＥＴ）酵素を提供し、操作されたＴＥＴ酵素は、５－メチルシトシン（５ｍＣ）から５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）へ、及び／または５ｈｍＣから５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）及び／または５－カルボキシシトシン（５ｃａＣ）への酸化を触媒する。 いくつかの好ましい実施形態では、システインで置換される少なくとも１つの非システインアミノ酸は、ＴＥＴ酵素のアイソフォームまたはオルソログにおいてシステインによって占有されるＴＥＴ酵素の触媒ドメイン内の位置で生じる。 いくつかの好ましい実施形態では、ＴＥＴ触媒ドメインは、マウスＴＥＴ２触媒ドメインであり、アイソフォームは、マウスＴＥＴ１である。いくつかの好ましい実施形態では、システインで置換される少なくとも１つの非システインアミノ酸は、１２８６、１２９１、１３２２、１８３５、及び１８３７、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される位置にあり、位置番号は、完全長マウスＴＥＴ２の位置番号に基づく。いくつかの好ましい実施形態では、置換は、Ａ１２８６Ｃ、Ｓ１２９１Ｃ、Ｋ１３３２Ｃ、Ｍ１８３５Ｃ及びＥ１８３７Ｃの置換、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択され、位置番号は、完全長マウスＴＥＴ２の位置番号に基づく。 いくつかの好ましい実施形態では、非システインアミノ酸で置換される触媒ドメイン内の少なくとも１つのシステインは、ＴＥＴ酵素のアイソフォームにおいて非システインによって占有されるＴＥＴ酵素の触媒ドメイン内の位置で生じる。 いくつかの好ましい実施形態では、ＴＥＴ触媒ドメインは、マウスＴＥＴ２触媒ドメインであり、アイソフォームは、マウスＴＥＴ１酵素である。いくつかの好ましい実施形態では、非システインアミノ酸で置換される少なくとも１つのシステインは、１１６８、１１７１、１１８５、１２７２、１７７２、１７９２及び１８２７、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される位置にあり、位置番号は、完全長マウスＴＥＴ２の位置番号に基づく。いくつかの好ましい実施形態では、置換は、Ｃ１１６８Ｙ、Ｃ１１７１Ｐ、Ｃ１１８５Ｔ、Ｃ１２７２Ｒ、Ｃ１７７２Ｓ、Ｃ１７９２Ｋ及びＣ１８２７Ｇの置換、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択され、位置番号は、完全長マウスＴＥＴ２の位置番号に基づく。 いくつかの好ましい実施形態では、操作されたＴＥＴ酵素の触媒ドメインは、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を共有するＮ末端部分及び配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を共有するＣ末端部分を有し、ただし、触媒ドメインは、Ａ１２８６Ｃ、Ｓ１２９１Ｃ、Ｋ１３３２Ｃ、Ｍ１８３５Ｃ、Ｅ１８３７Ｃ、Ｃ１１６８Ｙ、Ｃ１１７１Ｐ、Ｃ１１８５Ｔ、Ｃ１２７２Ｒ、Ｃ１７７２Ｓ、Ｃ１７９２Ｋ及びＣ１８２７Ｇの置換、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの置換からなり、位置番号は、完全長マウスＴＥＴ２の位置番号に基づく。いくつかの好ましい実施形態では、触媒ドメインのＮ末端部分は配列番号１に対応し、触媒ドメインのＣ末端部分は配列番号２に対応する。いくつかの好ましい実施形態では、触媒ドメインのＮ末端部分と触媒ドメインのＣ末端部分は、異種のリンカー配列によって接続される。 いくつかの好ましい実施形態では、ＴＥＴ触媒ドメインは、マウスＴＥＴ３触媒ドメインであり、アイソフォームは、マウスＴＥＴ１である。いくつかの好ましい実施形態では、システインで置換される少なくとも１つの非システインアミノ酸は、１０７６、１１１２、１７２１、及び１７２６、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される位置にあり、位置番号は、完全長マウスＴＥＴ３の位置番号に基づく。いくつかの好ましい実施形態では、置換は、Ａ１０７６Ｃ、Ｉ１１１２Ｃ、Ｍ１７２１Ｃ、及びＥ１７２６Ｃの置換、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択され、位置番号は、完全長マウスＴＥＴ３の位置番号に基づく。いくつかの好ましい実施形態では、操作されたＴＥＴ酵素は、さらに、９７５、１６５８、及び１６７８、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される位置のアミノ酸置換を含み、位置番号は、完全長マウスＴＥＴ３の位置番号に基づく。いくつかの好ましい実施形態では、置換は、Ａ９７５Ｔ、Ｎ１６５８Ｓ、及びＲ１６７８Ｋの置換、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択され、位置番号は、完全長マウスＴＥＴ３の位置番号に基づく。いくつかの好ましい実施形態では、操作されたＴＥＴ酵素の触媒ドメインは、配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性を共有するＮ末端部分及び配列番号４と少なくとも８０％の配列同一性を共有するＣ末端部分を有し、ただし、触媒ドメインは、Ａ１０７６Ｃ、Ｉ１１１２Ｃ、Ｍ１７２１Ｃ、Ｅ１７２６Ｃ、Ａ９７５Ｔ、Ｎ１６５８Ｓ、及びＲ１６７８Ｋの置換、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの置換からなり、位置番号は、完全長マウスＴＥＴ３の位置番号に基づく。いくつかの好ましい実施形態では、触媒ドメインのＮ末端部分は配列番号３に対応し、触媒ドメインのＣ末端部分は配列番号４に対応する。いくつかの好ましい実施形態では、触媒ドメインのＮ末端部分と触媒ドメインのＣ末端部分は、異種のリンカー配列によって接続される。 いくつかの好ましい実施形態では、ＴＥＴ触媒ドメインは、Ｌｙｇｕｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓのＴＥＴ２触媒ドメインであり、オルソログは、マウスＴＥＴ１である。いくつかの好ましい実施形態では、システインで置換される少なくとも１つの非システインアミノ酸は、７４０、７７３、及び１４００、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される位置にあり、位置番号は、部分的Ｌｙｇｕｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓ ＴＥＴ２の位置番号に基づく。いくつかの好ましい実施形態では、置換は、Ａ７４０Ｃ、Ｋ７７３Ｃ、及びＱ１４００Ｃの置換、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択され、位置番号は、部分長Ｌｙｇｕｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓ ＴＥＴ２の位置番号に基づく。いくつかの好ましい実施形態では、操作されたＴＥＴ酵素は、さらに、６２７、６４１、１３３７、及び１３５７、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される位置のアミノ酸置換を含み、位置番号は、部分長Ｌｙｇｕｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓ ＴＥＴ２の位置番号に基づく。いくつかの好ましい実施形態では、置換は、Ｖ６２７Ｐ、Ａ６４１Ｔ、Ｎ１３３７Ｓ、及びＨ１３５７Ｋの置換、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択され、位置番号は、完全長Ｌｙｇｕｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓ ＴＥＴ２の位置番号に基づく。いくつかの好ましい実施形態では、操作されたＴＥＴ酵素の触媒ドメインは、配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を共有するＮ末端部分及び配列番号６と少なくとも８０％の配列同一性を共有するＣ末端部分を有し、ただし、触媒ドメインは、Ａ７４０Ｃ、Ｋ７７３Ｃ、Ｑ１４００Ｃ、Ｖ６２７Ｐ、Ａ６４１Ｔ、Ｎ１３３７Ｓ、及びＨ１３５７Ｋの置換、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの置換からなり、位置番号は、部分長Ｌｙｇｕｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓ ＴＥＴ２の位置番号に基づく。いくつかの好ましい実施形態では、触媒ドメインのＮ末端部分は配列番号５に対応し、触媒ドメインのＣ末端部分は配列番号６に対応する。いくつかの好ましい実施形態では、触媒ドメインのＮ末端部分と触媒ドメインのＣ末端部分は、異種のリンカー配列によって接続される。 いくつかの好ましい実施形態では、ＴＥＴ触媒ドメインは、ヒトＴＥＴ２触媒ドメインであり、オルソログは、マウスＴＥＴ１である。いくつかの好ましい実施形態では、システインで置換される少なくとも１つの非システインアミノ酸は、１３７３、１４０９、１９２１、及び１９２３、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される位置にあり、位置番号は、完全長ヒトＴＥＴ２の位置番号に基づく。いくつかの好ましい実施形態では、置換は、Ａ１３７３Ｃ、Ｋ１４０９Ｃ、Ｍ１９２１