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JP-2026515019-A - 組み換え小分子コラーゲンおよびその発現システムと製造方法

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Abstract

本発明は、合成生物学、遺伝子工学とバイオテクノロジー分野に属する組み換え小分子コラーゲンおよびその発現システムと製造方法を提供している。本発明は、多種のＩＩＩ型、ＸＶＩＩ型コラーゲン由来の組み換え小分子コラーゲンを提供し、且つ見事に発現にする。本発明は、小分子コラーゲンの発現体系と小分子コラーゲンの製造方法を確立し、構築した専属シャーシ細胞と設計小分子コラーゲン縦列反復配列および組み換えベクターを含む。本発明の小分子コラーゲンは、経皮吸収と生物学的活性を両立させ、本発明の発現体系または方法は、小分子コラーゲンの発現に産量を大幅に向上させる。本発明の方案は、体外でプロテアーゼを使用して酵素を切断することによるコストと外因性タンパク残留リスクを避けると同時に、後続の精製工程の時間とコストを短縮することができる。 【選択図】図１６

Inventors

  • 李 佳佳
  • 程 鵬飛
  • 劉 慧敏
  • 銭 晨明
  • 蒋 ▲ウェン▼▲ウェン▼
  • 凡 孝菊
  • 李 海航
  • 銭 松

Assignees

  • 江蘇創健医療科技股▲ふん▼有限公司

Dates

Publication Date
20260513
Application Date
20240320
Priority Date
20230428

Claims (20)

  1. 組み換え小分子コラーゲン発現系であって、機能タンパク質連結ベクターを定位融合して宿主菌を形質変換して得られたシャーシ細胞またはシャーシ工学菌と組み換え小分子コラーゲンの縦列反復発現配列を含み、 ここで、前記縦列反復発現配列は、組み換え小分子コラーゲン、または人為的に設計された典型的なＧ－Ｘ－Ｙ３重構造を有するコラーゲン、またはヒトコラーゲン配列の２つまたは複数の領域を組み合わせたコラーゲンを基本ユニットとして縦列反復し、前記縦列反復発現配列における各隣接する２つの基本ユニット間にＫｅｘ２酵素、ＣＰＢ酵素の認識、切断部位を有し、 前記定位融合機能タンパク質は、ＣＰＢ酵素、細胞内膜定位または各細胞器間の変換と輸送作用を有する機能性領域を含み、前記定位融合機能タンパク質は、連結配列をさらに含み、前記連結配列は、ＣＰＢ酵素と細胞内膜定位または各細胞器間の変換と輸送作用を有する機能性領域配列との融合発現時の連結に用いられ、 前記定位融合機能タンパクは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２８に示すアミノ酸配列であり、 前記シャーシ細胞またはシャーシエンジニアリング菌は、酵母から選ばれる、ことを特徴とする組み換え小分子コラーゲン発現系。
  2. 前記縦列反復発現配列における各隣接する２つの基本ユニット間にさらにＳｔｅ１３酵素の認識、切断部位を含んでもよい、ことを特徴とする請求項１に記載の発現系。
  3. 前記Ｋｅｘ２酵素が切断を認識する部位は、ＫＲまたはＲＲ二重塩基性アミノ酸残基を含み、二重塩基性アミノ酸残基の後に、ＥＡ、ＥＡＥＡまたはＫｅｘ２酵素またはＳｔｅ １３酵素の認識及び切断に役立つ他のアミノ酸残基である、ことを特徴とする請求項２に記載の発現系。
  4. 前記ＣＰＢ酵素の認識及び切断部位は、タンパク質カルボキシル末端の塩基性アミノ酸残基を含み、Ｋ、Ｒを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の発現系。
  5. 前記組み換え小分子コラーゲンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６７で示すアミノ酸の配列である、ことを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載の発現系。
  6. 前記組み換え小分子コラーゲンのカルボキシル末端は、複数のＨｉｓを有する、ことを特徴とする請求項５に記載の発現系。
  7. 前記組み換え小分子コラーゲンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示すアミノ酸の配列である、ことを特徴とする請求項６に記載の発現系。
  8. 前記縦列反復発現配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６４またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６８に示す配列である、ことを特徴とする請求項１に記載の発現系。
  9. 前記縦列反復発現配列をコードする核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７１－８１に示す配列、またはその縮重配列である、ことを特徴とする請求項８に記載の発現系。
  10. 前記ＣＰＢ酵素は、ヒトまたはラットに由来する、ことを特徴とする請求項１に記載の発現系。
  11. 前記ＣＰＢ酵素配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７－１８に示す通りである、ことを特徴とする請求項１０に記載の発現システム。
  12. 前記細胞内膜定位または各細胞間の変換と輸送作用を有する機能領域配列は、酒醸造用酵母またはピキア・パストリスのＫｅｘ２酵素に由来する、ことを特徴とする請求項１に記載の発現系。
  13. 前記細胞内膜定位または各細胞器間の変換と輸送作用を有する機能領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９～２０に示す、ことを特徴とする請求項１２に記載の発現システム。
  14. 前記連結配列は、Ｌｉｎｋｅｒ配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１に示すＧＧＳＧＳＧＳＧＧＳの通りである、ことを特徴とする請求項１に記載の発現系。
  15. 前記定位融合機能タンパクをコードする核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９に示すヌクレオチド配列、またはその縮重配列である、ことを特徴とする請求項１に記載の発現システム。
  16. 前記シャーシ細胞またはシャーシエンジニアリング菌は、中国微生物菌種類保蔵管理委員会普通微生物センターに保蔵され、保蔵番号は、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５８１５、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５８１７、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５８１６、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５８１８である、ことを特徴とする請求項１に記載の発現系。
  17. 請求項１～１６のいずれかに記載の発現系の組み換え小分子コラーゲンの取得における応用。
  18. 組み換え小分子コラーゲンを製造する方法であって、請求項１～１６のいずれか一項に記載の発現系を用い、 組み換え小分子コラーゲンの縦列反復発現配列を構築し、前記縦列反復発現配列は、組み換え小分子コラーゲン、または人為的に設計された典型的なＧ－Ｘ－Ｙ３重構造を有するコラーゲン、またはヒトコラーゲン配列の２つまたは複数の領域を組み合わせたコラーゲンを基本ユニットとして縦列反復し、前記縦列反復発現配列における各隣接する２つの基本ユニット間にＫｅｘ２酵素、ＣＰＢ酵素の認識、切断部位を有することと、 定位融合機能タンパクを構築し、定位融合機能タンパク連結ベクターを宿主菌に形質変換してシャーシ細胞またはシャーシエンジニアリング菌を得ることと、 組み換え小分子コラーゲンの縦列反復発現配列を発現ベクターに連結した後にシャーシ細胞またはシャーシエンジニアリング菌の中に移し、組み換え小分子コラーゲンを含むか、または発現する組み換えエンジニアリング菌を得、発酵して発現を誘導し、組み換え小分子コラーゲンを得ることとを含む、ことを特徴とする方法。
  19. 前記組み換え小分子コラーゲンを含むか、または発現する組み換えエンジニアリング菌は、中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに保蔵され、保蔵番号は、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５８１９、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５８２１、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５８２７、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５８２９、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５８２８、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５８２０、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５８２２である、ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
  20. 前記方法で得られた組み換え小分子コラーゲンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７０に示すアミノ酸の配列である、ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。

Description

本発明は組み換え小分子コラーゲンおよびその発現システムと製造方法に関し、合成生物学、遺伝子工学とバイオテクノロジー分野に属する。 コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）は、多種生物学機能を有し、良好な生物的適合性、生物学的活性及び分解性等の独特な機能特徴を有し、最も理想的な生物材料由来であり、化学工業、医薬、化粧品等の多くの分野に広く応用され、広い応用見通しを有する。現在、市場では動物由来のコラーゲンは、主導的な地位を占めており、ここ数年、遺伝子工学で作成した組み換えコラーゲンは、発展し始めるが、動物由来のコラーゲンか組み換えコラーゲンかに関わらず、多くは、長いアミノ酸配列、大分子量のタンパク質であり、動物由来のコラーゲン分子量は、一般的に１００～３００ｋＤａ以上であり、組み換えコラーゲン分子量も一般的に２０ｋＤａ以上（２００個のアミノ酸以上）であり、５０ｋＤａが多数である。このような大分子量のコラーゲンは、生物材料として組織再生修復、移植類の医療器械、導入類の医療美容製品に応用され、いずれも適当であるが、いくつかの経皮吸収を必要とする応用シーンに適合しない。 動物性由来の分子量が比較的小さいコラーゲンの多くは、小分子コラーゲンポリペプチドであり、経皮吸収を必要とする応用シーンで多く使用され、例えば、水産物由来の小分子コラーゲンポリペプチドであるが、これらの製品の多くは、酵素分解、加水分解、酸塩基分解などの方式で製造して得られ、得られた小分子コラーゲンポリペプチドは、アミノ酸配列、分子量が明確で、大きさが単一である小分子タンパクではなく、総称であり、分子量が極めて小さい数ペプチドから一定のアミノ酸配列の長さの小分子コラーゲンポリペプチドまでいずれも分布し、種類、数をほとんど確定できない場合、アミノ酸配列もランダム（未知）であり、異なるロットで製造した小分子コラーゲンポリペプチドの品質も基本的にランダムであり、そのアミノ酸配列、分子量の大きさは、いずれも分布し、割合は、いずれも制御できない。以上のように、従来の小分子コラーゲン類の製品は、研究も比較的多いが、その多くは、動物由来のコラーゲンを処理（酵素分解、加水分解）して得られた複合物であり、経皮吸収に関連する応用があるが、アミノ酸配列、分子量、ロット間の差異などは、いずれも有効に制御することができない。 出願番号ＣＮ２０２２１１５７９８４８．５の特許は、小分子組み換えコラーゲンペプチドおよびその製造方法を開示し、本質は、依然として動物源の小コラーゲンペプチドに類似する製造方法であり、得られた小分子組み換えコラーゲンペプチドは、多種のアミノ酸配列が異なり、分子量の大きさが異なる（その平均分子量だけを計算できる）コラーゲンポリペプチドの混合物であり、アミノ酸配列、分子量が明確で単一の組み換え小分子コラーゲン（ポリペプチド）ではない。しかし、他の従来の組み換え小分子コラーゲンポリペプチドは、小分子量と生物学的活性のバランスを取りにくい。合成生物学、遺伝子工学で作製された組み換えコラーゲンの多くは、中、大分子量の製品であり（一部の研究開発成果は、ポリペプチドと呼ばれるが、アミノ酸の数は、すでに１００個よりはるかに多く、すでに小分子の範疇に属しない）、ごく少数の組み換え小分子コラーゲンポリペプチドの研究成果のみがあり、その組み換えコラーゲンのアミノ酸配列分子量は、比較的小さい。コラーゲンは、活性物質として、その生物学的活性を支持するために一定のアミノ酸配列と配列の長さを必要とし、すなわち小分子量と生物学的活性は、バランスの状態に達する必要があり、それで意義があるが、従来の小分子の組み換えコラーゲンポリペプチドは、それが良好な生物学的活性を有することを示す相応の証拠がない。 その他の小分子タンパク質またはポリペプチドは、組み換え発現を行う時に同様であり、組み換え小分子コラーゲン全体のアミノ酸の数が少なく、分子量が小さく、遺伝子組み換え発現システムの中で、特に真核発現システム（たとえばピキア・パストリス発現システム、哺乳動物細胞発現システム）の中で、その発現効率、生産量は、極めて大きい制限を受ける。タンデム発現のようないくつかの技術は、遺伝子コピー数を増加させるが、しばしば小分子タンパク質またはポリペプチドに不必要なアミノ酸を導入する。コラーゲンは、特殊なタンパク質であり、その典型的な特徴は、そのアミノ酸配列がＧ－Ｘ－Ｙ三量体繰り返し構造であり、必要でないアミノ酸を導入するとよくこの三量体繰り返し構造を破壊し、その機能活性などに影響する。 従来の組み換え小分子コラーゲンまたは多重組み換え小分子コラーゲンポリペプチドの研究は、少なく、明確な組み換え小分子コラーゲンの製品は、基本的に空白にあり、かつ発現量の問題に関するものはさらに少ない。リーダーペプチドを融合する方法を使用して小分子タンパク質の発現量を向上させる研究があり、例えば公開番号がＣＮ１０８１４８１１４Ｂの特許であるが、発現する必要のある小分子タンパク質が体外（細胞）でプロテアーゼを使用して酵素を切断してリーダーペプチドを除去する必要があり、発現産物に人為的に外因性のタンパクを導入し、後続の精製技術の工程、コストを増加し、外因性タンパク質残留のリスクももたらす。またある研究は、小分子タンパク質タンデム発現の方法を使用して発現効率を向上させ、それによって産量を向上させる目的に達し、例えばＣＮ１１０３０５８９０Ａは、５種類の抗菌ペプチドに対するタンデム発現組み換えを使用するが、使用するのは、ギ酸で縦列のポリペプチドを切断し、切断部位は、ＤＰの２つのアミノ酸残基間だけに位置することができ、設計空間が制限され、かつ切断した後にＤＰも有効に除去することができず、非自己アミノ酸になり、同様に人為的に外因性タンパクを導入することに属する。これらの提案も組み換え小分子コラーゲンの発現生産に用いることを開示していない。 そのため、前記技術分野は、組み換え小分子コラーゲンの発現に関し、小分子量、生物学的活性を有し、規模化の量産ができ、発現量が高く、かつそのアミノ酸配列と分子量が単一で明確であり、混合物ではないなどの多方面の平衡が必要であり、有効な解決方式が緊急に必要である。 本発明の目的は、従来技術に存在する複数の技術問題を克服し、組み換え小分子コラーゲン、その発現システムおよびその製造方法を提供することである。前記目的を達成するために、本発明は下記の技術方案を採用する。 本発明は、まず組み換え小分子コラーゲンを提供し、前記組み換え小分子コラーゲンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６７に示すアミノ酸配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６３またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６７と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつコラーゲン生物学的活性を維持する。 さらに、前記組み換え小分子コラーゲンのカルボキシル末端は、複数のＨｉｓを有し、６×Ｈｉｓタグを形成することができる。 さらに、前記組み換え小分子コラーゲンは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示すアミノ酸配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつコラーゲン生物学的活性を維持する。本発明は、前記組み換え小分子コラーゲンをコードする核酸をさらに提供する。さらに、前記核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９～１６に示すヌクレオチド配列、またはその縮重配列を含む。 本発明は、前記核酸を含む組み換えベクターをさらに提供し、前記ベクターは、ｐＰＩＣＺαＢ、ｐＦＬＤα、ｐＰＩＣ９Ｋを含み、連結部位は、Ｋｅｘ２酵素切断点配列とＮｏｔＩ酵素切断点との間である。 本発明は、前記核酸を含むか、または前記組み換えベクターを含むか、または前記組み換え小分子コラーゲンを発現する組み換えエンジニアリング菌をさらに提供する。 さらに、前記エンジニアリング菌の宿主菌は、ピキア・パストリス、酒醸造用酵母、ハンセヌラ・ポリモルファなどを含み、ピキア・パストリスが好ましい。 本発明の実施例によれば、前記エンジニアリング菌は、中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに保蔵され、保蔵番号は、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５８１１、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５８２３、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５８１２、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５８２４、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５８２５、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５８１３、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５８２６、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５８１４である。 本発明は、組み換え小分子コラーゲンの縦列反復発現配列をさらに提供し、前記縦列反復発現配列は、前記組み換え小分子コラーゲン、または人為的に設計された典型的なＧ－Ｘ－Ｙ３重構造を有するコラーゲン、またはヒトコラーゲン配列の２つまたは複数の領域を組み合わせたタンパクを基本ユニットとして縦列反復し、前記縦列反復発現配列における隣接する２つの前記組み換え小分子コラーゲン間にＫｅｘ２酵素、ＣＰＢ酵素で認識及び切断される部位を有し、さらに同時にＳｔｅ１３酵素の認識、切断部位を有する。 前記縦列反復発現配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６８に示す配列、または前記８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。 本発明の実施例によれば、前記Ｋｅｘ２酵素で認識及び切断される部位は、ＫＲまたはＲＲ二重塩基性アミノ酸残基を含み、二重塩基性アミノ酸残基の後は、ＥＡ、ＥＡＥＡまたはＫｅｘ２酵素またはＳｔｅ １３酵素の認識と切断に役立つ他のアミノ酸残基である。 本発明の実施例によれば、前記ＣＰＢ酵素で認識及び切断される部位は、タンパクカルボキシル末端の塩基性アミノ酸残基を含み、Ｋ、Ｒを含む。 本発明の実施例によれば、前記縦列反復の小分子コラーゲンモノマー（または断片）のアミノ酸配列は、任意の配列であってもよく、そのアミノ酸残基の具体的な順序、配列の長さ、モノマー（または断片）の縦列反復の回数は、制限されないが、典型的なＧ－Ｘ－Ｙの３重構造を有する必要がある。 本発明は、前記縦列反復発現配列をコードする核酸をさらに提供し、さらに、前記核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７１～８１に示す配列、またはその縮重配列を含む。 本発明は、前記縦列反復発現配列をコードする核酸を含む組み換えベクターをさらに提供する。本発明の実施例によれば、前記ベクターは、ｐＰＩＣＺαＢ、ｐＦＬＤα、ｐＰＩＣ９Ｋなどの発現ベクターを含むが、それらに限らない。 本発明は、前記核酸、または組み換えベクターを含むエンジニアリング菌をさらに提供する。 本発明の実施例によれば、前記エンジニアリング菌の宿主菌は、ピキア・パストリス、酒醸造用酵母、ハンセヌラ・ポリモルファなどを含み、ピキア・パストリスが好ましい。