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JP-2026515021-A - ＣＬＬ１を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞及びその製造方法と使用

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Abstract

本発明は、ＣＬＬ１を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞及びその製造方法と使用に関する。具体的には、キメラ抗原受容体を含有するＣＡＲ－Ｔ細胞に関し、キメラ抗原受容体は、単一ドメイン抗体、ヒンジ領域、膜貫通領域、及び細胞内シグナル領域を含み、単一ドメイン抗体のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の２２～１５０位である。実験により、ＣＬＬ１－ＶＨＨ－１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｔ細胞の特異的エフェクター分子ＩＦＮ－γを効果的に分泌し、ＣＬＬ１陽性標的細胞を効率的かつ特異的に殺傷し、優れたインビボ腫瘍殺傷活性を示し、マウスにおける腫瘍細胞の増殖を有意に阻害するだけでなく、マウスの生存期間を有意に延長可能なことが実証されている。ＣＬＬ１－ＶＨＨ－１６ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、優れた抗腫瘍能力を有し、ＣＬＬ１標的関連疾患の免疫療法に用いることができ、幅広い臨床応用の可能性を有する。 【選択図】なし

Inventors

  • 楊▲しん▼
  • 朱建高
  • 楊文君
  • 兪建東

Assignees

  • 浙江康佰裕生物科技有限公司

Dates

Publication Date
20260513
Application Date
20231220
Priority Date
20230428

Claims (16)

  1. ＣＡＲ－Ｔ細胞であって、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞はキメラ抗原受容体を含有し、前記キメラ抗原受容体は、単一ドメイン抗体、ヒンジ領域、膜貫通領域、及び細胞内シグナル領域を含み、前記単一ドメイン抗体のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の２２～１５０位である、ことを特徴とする、ＣＡＲ－Ｔ細胞。
  2. 前記細胞内シグナル領域は、共刺激ドメイン４－１ＢＢと活性化ドメインＣＤ３ζを含み、前記４－１ＢＢのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の２２０～２６６位であり、前記ＣＤ３ζのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の２６７～３７８位である、ことを特徴とする、請求項１に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
  3. 前記ヒンジ領域は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の１５１～１９５位であるＣＤ８ａヒンジ領域であり、前記膜貫通領域は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の１９６～２１９位であるＣＤ８ａ膜貫通領域である、ことを特徴とする、請求項１又は２に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
  4. 前記キメラ抗原受容体は、以下のいずれか１つを含む、ことを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞： Ａ１）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の２２～３７８位に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、 Ａ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の２２～３７８位に示すアミノ酸配列においてアミノ酸残基が置換及び／又は欠失及び／又は付加された、Ａ１）に記載のタンパク質と８０％以上の同一性を有しかつ同一の機能を有するタンパク質、 Ａ３）Ａ１）又はＡ２）のＮ末端及び／又はＣ末端にタグ又はシグナルペプチドを付加した、Ａ１）と同一の機能を有する融合タンパク質。
  5. Ａ３）に記載のシグナルペプチドのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の１～２１位である、ことを特徴とする、請求項４に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
  6. 請求項１～５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
  7. 以下のいずれか１つである、ことを特徴とする、生体材料： Ｂ１）請求項６に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸分子、 Ｂ２）Ｂ１）に記載の核酸分子を含む発現カセット、 Ｂ３）Ｂ１）に記載の核酸分子を含む組換えベクター、又はＢ２）に記載の発現カセットを含む組換えベクター、 Ｂ４）Ｂ１）に記載の核酸分子を含む組換え微生物、又はＢ２）に記載の発現カセットを含む組換え微生物、又はＢ３）に記載の組換えベクターを含む組換え微生物。
  8. Ｂ１）に記載の核酸分子は、以下のいずれか１つである、ことを特徴とする、請求項７に記載の生体材料： Ｃ１）ヌクレオチド配列又はコード配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２の６４～１１３４位であるＤＮＡ分子、 Ｃ２）Ｃ１）で定義されるヌクレオチド配列と７５％以上の同一性を有しかつ同一の機能を有するＤＮＡ分子、 Ｃ３）ヌクレオチド配列又はコード配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２であるＤＮＡ分子、 Ｃ４）Ｃ３）で定義されるヌクレオチド配列と７５％以上の同一性を有しかつ同一の機能を有するＤＮＡ分子。
  9. 請求項１～５のいずれか一項に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞を含む、ことを特徴とする、医薬組成物。
  10. 請求項１～５のいずれか一項に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞、又は請求項６に記載のキメラ抗原受容体、又は請求項７又は８に記載の生体材料、又は請求項９に記載の医薬組成物の、以下のいずれか１つの使用： Ｄ１）腫瘍の予防又は治療のための医薬品の製造における使用、又は腫瘍の予防又は治療における使用、 Ｄ２）ＣＬＬ１標的関連疾患の予防又は治療のための医薬品の製造における使用、又はＣＬＬ１標的関連疾患の予防又は治療における使用。
  11. 前記ＣＬＬ１標的関連疾患は、ＣＬＬ１陽性がんである、ことを特徴とする、請求項１０に記載の使用。
  12. 前記ＣＬＬ１陽性がんは、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、又は慢性骨髄性白血病である、ことを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
  13. 請求項１～５のいずれか一項に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞を製造する方法であって、請求項７又は８に記載の核酸分子をＴ細胞に導入して安定発現させ、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞を得ることを含む、ことを特徴とする、方法。
  14. ＣＬＬ１標的関連疾患を予防又は治療する方法であって、請求項１～５のいずれか一項に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞又は請求項９に記載の医薬組成物を、ＣＬＬ１標的関連疾患に罹患している対象に投与することを含む、ことを特徴とする、方法。
  15. 前記ＣＬＬ１標的関連疾患は、ＣＬＬ１陽性がんである、ことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記ＣＬＬ１陽性がんは、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、又は慢性骨髄性白血病である、ことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。

Description

本発明は、細胞免疫治療の技術分野に属し、具体的にはＣＬＬ１を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞及びその製造方法と使用に関する。 急性骨髄性白血病（Ａｃｕｔｅ Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＡＭＬ）は、骨髄造血幹／前駆細胞の悪性疾患である。長期にわたり、軽症患者の治療にはアントラサイクリンとシタラビンの化学療法が使用され、中・高リスク患者の治療には造血幹細胞移植が使用されてきた。急性骨髄性白血病の不均一性により、現在、ＡＭＬ患者の治療は依然として困難である。近年、研究者は、ＣＬＬ１を標的とする免疫療法がＡＭＬの治療に有効であることを発見した。Ｃ型レクチン様分子１（Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １、ＣＬＬ１）は、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ ｄｏｍａｉｎ ｆａｍｉｌｙ １２ ｍｅｍｂｅｒ Ａ、ＣＬＥＣ１２Ａ）としても知られ、抑制受容体として免疫調節において重要な役割を果たすＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＣＬＬ１は、末梢血、骨髄の骨髄細胞、及びほとんどのＡＭＬ細胞に存在し、多くのＡＭＬのＣＤ３４＋ＣＤ３８－幹細胞に発現しているが、正常なＣＤ３４＋ＣＤ３８－幹細胞には発現していないので、ＣＬＬ１は、その特殊な発現パターンから、ＡＭＬの治療及び診断における潜在的な標的となっている。さらに、ＣＬＬ１は、骨髄異形成症候群（Ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ、ＭＤＳ）及び慢性骨髄性白血病（Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＣＭＬ、慢性顆粒球性白血病）の細胞にも発現している。 従来の放射線療法、化学療法、及び造血幹細胞移植ではＡＭＬの治療の有効率が低いが、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の登場によりＡＭＬの治癒が可能になった。ＣＡＲ－Ｔは、Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、すなわちキメラ抗原受容体Ｔ細胞免疫療法の略である。キメラ抗原受容体技術は、遺伝子工学技術を用いて免疫細胞を改変し、外因性抗腫瘍遺伝子（ＣＡＲ遺伝子）を発現させることで、リンパ球などの免疫細胞が腫瘍細胞の表面抗原を認識する能力を有し、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の制限を受けずに腫瘍細胞を特異的に認識して殺傷することが可能になる。ＣＡＲの構造は、主に腫瘍細胞の表面抗原を認識する細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインで構成されている。細胞外ドメインは、腫瘍表面の特異的タンパク質（抗原）を特異的に認識するために使用され、一方、細胞内ドメインは、共刺激分子ドメインを含んでおり、腫瘍表面の特異的タンパク質（抗原）が認識された後、リンパ球の免疫応答を開始し、特異的な標的細胞に対して細胞傷害性効果を発揮し、標的細胞（腫瘍細胞）を殺傷するために使用される。現在、ＣＡＲ－Ｔ技術は、臨床医学に応用されており、世界中で多数の臨床成功例が報告されている。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、Ｂ細胞腫瘍などの血液悪性腫瘍において有望な有効性を示している。しかし、骨髄細胞の抗原特性はＢ細胞とは根本的に異なり、ＣＡＲ－Ｔによる正常な骨髄細胞の傷害が骨髄不全につながり、対応する補充療法がないため、ＡＭＬに対するＣＡＲ－Ｔ療法の進歩は非常に遅れている。ＡＭＬにおけるＣＡＲ－Ｔ技術の成功には、依然として多くの課題が残っている。したがって、新規かつ効果的なＣＡＲ－Ｔ細胞のさらなる徹底的な研究開発とＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性の向上は、ＡＭＬの免疫細胞療法にとって重要な理論的意義及び臨床応用価値を持っている。 本発明の目的の一つは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療に用いるＣＬＬ１を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞を提供することである。解決しようとする技術的課題は、説明された技術的主題に限定されるものではなく、当業者は、本明細書に記載されていない他の技術的主題についても、以下の説明を通じて明確に理解することができる。 上記目的を達成するために、本発明は、キメラ抗原受容体を含有するＣＡＲ－Ｔ細胞を提供する。キメラ抗原受容体は、単一ドメイン抗体、ヒンジ領域、膜貫通領域、及び細胞内シグナル領域を含んでもよく、単一ドメイン抗体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の２２～１５０位であってもよい。 ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＡＲ発現Ｔ細胞又はＣＡＲ改変Ｔ細胞）はＣＬＬ１を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞であってもよく、ＣＡＲ－Ｔ細胞はキメラ抗原受容体を発現する。 さらに、細胞内シグナル領域は、共刺激ドメイン４－１ＢＢ及び活性化ドメインＣＤ３ζを含んでもよく、４－１ＢＢのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の２２０～２６６位であってもよく、ＣＤ３ζのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の２６７～３７８位であってもよい。 さらに、ヒンジ領域は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の１５１～１９５位であるＣＤ８ａヒンジ領域であってもよく、膜貫通領域は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の１９６～２１９位であるＣＤ８ａ膜貫通領域であってもよい。 さらに、キメラ抗原受容体は、ＣＬＬ１－ＶＨＨ－１６ ＣＡＲと命名され、以下のいずれか１つを含んでもよい： Ａ１）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の２２～３７８位に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、 Ａ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の２２～３７８位に示すアミノ酸配列においてアミノ酸残基が置換及び／又は欠失及び／又は付加された、Ａ１）に記載のタンパク質と８０％以上の同一性を有しかつ同一の機能を有するタンパク質、 Ａ３）Ａ１）又はＡ２）のＮ末端及び／又はＣ末端にタグ又はシグナルペプチドを付加した、Ａ１）と同一の機能を有する融合タンパク質。 さらに、Ａ３）に記載のシグナルペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１の１～２１位であってもよい。 さらに、キメラ抗原受容体は、以下のいずれか１つを含んでもよい： Ｅ１）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、 Ｅ２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示すアミノ酸配列においてアミノ酸残基が置換及び／又は欠失及び／又は付加された、Ｅ１）に記載のタンパク質と８０％以上の同一性を有しかつ同一の機能を有するタンパク質、 Ｅ３）Ｅ１）又はＥ２）のＮ末端及び／又はＣ末端にタグを付加した、Ｅ１）と同一の機能を有する融合タンパク質。 本明細書に記載のタグは、ＧＳＴ（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ）タグタンパク質、Ｈｉｓ６タグタンパク質（Ｈｉｓ－ｔａｇ）、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）タグタンパク質、Ｆｌａｇタグタンパク質、ＳＵＭＯタグタンパク質、ＨＡタグタンパク質、Ｍｙｃタグタンパク質、ｅＧＦＰ（強化緑色蛍光タンパク質）、ｅＣＦＰ（強化シアン蛍光タンパク質）、ｅＹＦＰ（強化黄色蛍光タンパク質）、ｍＣｈｅｒｒｙ（単量体赤色蛍光タンパク質）、又はＡｖｉＴａｇタグタンパク質を含むが、これらに限られない。 当業者は、指向性進化法や点突然変異法などの公知の方法を用いて、本発明のキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を容易に変異させることができる。これらの人工的に改変された、本発明のキメラ抗原受容体のヌクレオチド配列と７５％以上の同一性を有するヌクレオチドは、キメラ抗原受容体をコードしかつキメラ抗原受容体の機能を有する限り、本発明のヌクレオチド配列に由来しかつ本発明の配列と同等するものである。 本明細書に記載のキメラ抗原受容体のいずれもが本発明の保護範囲内である。 キメラ抗原受容体は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、シグナルペプチド、単一ドメイン抗体、ヒンジ領域、膜貫通領域、共刺激ドメイン、及び活性化ドメインを順次含んでもよい。。 本発明は、生体材料をさらに提供する。生体材料は、以下のいずれか１つであってもよい： Ｂ１）本明細書に記載のいずれかのキメラ抗原受容体をコードする核酸分子、 Ｂ２）Ｂ１）に記載の核酸分子を含む発現カセット、 Ｂ３）Ｂ１）に記載の核酸分子を含む組換えベクター、又はＢ２）に記載の発現カセットを含む組換えベクター、 Ｂ４）Ｂ１）に記載の核酸分子を含む組換え微生物、又はＢ２）に記載の発現カセットを含む組換え微生物、又はＢ３）に記載の組換えベクターを含む組換え微生物。 上記生体材料において、Ｂ１）に記載の核酸分子は、以下のいずれか１つであってもよい： Ｃ１）ヌクレオチド配列又はコード配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２の６４～１１３４位であるＤＮＡ分子、 Ｃ２）Ｃ１）で定義されるヌクレオチド配列と７５％以上の同一性を有しかつ同一の機能を有するＤＮＡ分子、 Ｃ３）ヌクレオチド配列又はコード配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２であるＤＮＡ分子、 Ｃ４）Ｃ３）で定義されるヌクレオチド配列と７５％以上の同一性を有しかつ同一の機能を有するＤＮＡ分子。 本発明の一実施形態では、キメラ抗原受容体は、ＣＬＬ１－ＶＨＨ－１６ ＣＡＲと命名され、Ｎ末端からＣ末端にかけて、シグナルペプチド（Ｓｉｇｎａｌ）、単一ドメイン抗体（ＣＬＬ１－ＶＨＨ－１６）、ＣＤ８ａヒンジ領域（Ｈｉｎｇｅ）、ＣＤ８ａ膜貫通領域、共刺激ドメイン４－１ＢＢ、及び活性化ドメインＣＤ３ζの順である（図１）。このうち、単一ドメイン抗体は、ＣＬＬ１タンパク質に特異的に結合する単一ドメイン抗体ＣＬＬ１－ＶＨＨ－１６であり、単一ドメイン抗体ＣＬＬ１－ＶＨＨ－１６は、ＣＡＲの細胞外抗原結合領域であり、腫瘍表面抗原ＣＬＬ１を認識して結合する役割を担う。抗原結合領域の前（Ｎ末端）には、腫瘍表面抗原ＣＬＬ１を認識するように、抗原結合領域のペプチド鎖の細胞外への移行を誘導するためのシグナルペプチド（Ｓｉｇｎａｌ）が付加されている。ＣＤ８ａヒンジ領域（Ｈｉｎｇｅ）は、細胞外に位置するＣＡＲのペプチド鎖であり、細胞外抗原結合領域とＣＤ８ａ膜貫通領域を連結している。ＣＤ８ａ膜貫通領域は、単一ドメイン抗体（ＣＬＬ１－ＶＨＨ－１６）を細胞膜に固定するために使用される。細胞内シグナル領域は、共刺激ドメイン４－１ＢＢと活性化ドメインＣＤ３ζを含み、Ｔ細胞を相乗的に刺激し、細胞内シグナルを活性化し、Ｔ細胞の持続的な増殖とサイトカイン放出を可能にし、Ｔ細胞の抗腫瘍能力を増強するとともに、Ｔ細胞のシグナル伝達機能を発揮し、より強力で持続的なＴ細胞応答を促進するために使用される。 ＣＬＬ１－ＶＨＨ－１６ ＣＡＲのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されており、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１の１～２１位はシグナルペプチド（Ｓｉｇｎａｌ）のアミノ酸配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１の２２～１５０位は単一ドメイン抗体（ＣＬＬ１－ＶＨＨ－１６）のアミノ酸配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１の１５１～１９５位はＣＤ８ａヒンジ領域（Ｈｉｎｇｅ）のアミノ酸配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１の１９６～２１９位はＣＤ８ａ膜貫通領域のアミノ酸配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１の２２０～２６６位は共刺激ドメイン４－１ＢＢのアミノ酸配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１の２６７～３７８位は活性化ドメインＣＤ３ζのアミノ酸配列である。 ＣＬＬ１－ＶＨＨ－１６ ＣＡＲをコードする遺伝子はＣＬＬ１－ＶＨＨ－１６ ＣＡＲ遺伝子であり、そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されている。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２の１～６３位はシグナルペプチド（Ｓｉｇｎａｌ）のヌクレオチド配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２の６４～４５０位は単一ドメイン抗体（ＣＬＬ１－ＶＨＨ－１６）のヌクレオチド配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２の４５１～５８５位はＣＤ８ａヒンジ領域（Ｈｉｎｇｅ）のヌクレオチド配列であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２の５８６～６５７位はＣＤ８ａ膜貫通領域のヌクレオチド配列であり、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ