JP-2026515028-A - 微生物細胞の迅速な分離及び検出のための方法及びデバイス

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Abstract

微生物細胞の迅速な検出の方法が提供される。いくつかの実施形態では、微生物細胞は、試料から得られ、且つ固体増殖培地に播種され、インキュベートされ、及びマイクロコロニーを検出するために監視される。マイクロコロニーからの微生物細胞が回収されて、迅速な核酸増幅及び／又は配列決定のための微生物細胞を提供する。微生物細胞は、宿主血液細胞を血液溶解試薬で溶解させ、且つ微生物細胞を分離して懸濁液を得ることにより、全血を含有する試料から得ることができる。全血試料が、サポニン及びポリアネトールスルホン酸ナトリウムを含有する血液溶解試薬と混合されて、第１の混合物を形成し、且つその後、アルカリ性緩衝液と混合されて第２の混合物を形成する、全血試料から微生物細胞を分離する方法が提供される。その後、微生物細胞を第２の混合物から分離するために分離プロセスが用いられる。【選択図】図１Ａ

Inventors

タレブプール，サマド
レオナード，スティーブンウェスリー
ヒムチェンコ，アンナ
マンク，スークデヴ

Assignees

シェムロンホールディングスインコーポレーテッド

Dates

Publication Date: 20260513
Application Date: 20240426
Priority Date: 20230428

Claims (20)

微生物細胞のマイクロコロニーに由来する核酸で核酸増幅を実施する方法であって、固体増殖培地で前記マイクロコロニーの存在を検出することと、前記マイクロコロニーの直径が１００ミクロン未満のままである間に微生物細胞を前記マイクロコロニーから回収し、それにより回収された微生物細胞を得ることと、前記回収された微生物細胞を溶解させ、それにより溶解物を得ることと、介在する増殖ステップの非存在下で核酸増幅を実施して、前記溶解物内に存在する少なくとも１つの核酸を増幅し、それにより増幅産物を得ることとを含む方法。
前記増幅産物の存在を検出することを更に含む、請求項１に記載の方法。
核酸増幅によって増幅された少なくとも１つの核酸は、薬剤耐性遺伝子を含む、請求項２に記載の方法。
前記核酸増幅は、複数の核酸を増幅するように構成される、請求項２に記載の方法。
前記複数の核酸の少なくとも１つは、薬剤耐性遺伝子を含む、請求項４に記載の方法。
前記複数の核酸は、薬剤耐性遺伝子の組を含む、請求項４に記載の方法。
前記複数の核酸の少なくとも１つは、薬剤耐性遺伝子を含み、及び前記複数の核酸の少なくとも１つは、微生物種と固有に関連する、請求項４に記載の方法。
前記複数の核酸の少なくとも１つは、薬剤耐性遺伝子を含み、及び前記複数の核酸の少なくとも１つは、微生物属と固有に関連する、請求項４に記載の方法。
前記複数の核酸の少なくとも１つは、薬剤耐性遺伝子を含み、及び前記複数の核酸の少なくとも１つは、微生物株と固有に関連する、請求項４に記載の方法。
前記複数の核酸の少なくとも２つは、薬剤耐性遺伝子とそれぞれ関連し、前記複数の核酸の少なくとも２つは、固有の微生物属、株又は種とそれぞれ関連する、請求項４に記載の方法。
前記核酸の少なくとも２つは、多重増幅反応で増幅される、請求項４～１０のいずれか一項に記載の方法。
前記核酸増幅は、前記溶解物からの核酸抽出の実施なしに実施される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
前記微生物細胞は、グラム陽性微生物細胞であり、及び前記微生物細胞の溶解は、熱溶解によって実施される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
前記増幅産物で配列決定を実施することを更に含む、請求項１に記載の方法。
前記核酸増幅は、全ゲノム増幅を含む、請求項１４に記載の方法。
前記マイクロコロニーの前記存在を検出する前に、試料を得ることと、前記試料を培養することなく、前記試料からの微生物細胞を前記固体増殖培地に播種することと、前記固体増殖培地をインキュベートし、且つ前記固体増殖培地を１つ以上のマイクロコロニーの存在について監視することとを更に含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
前記試料からの微生物細胞を前記固体増殖培地に播種することは、前記試料を前記固体増殖培地と直接接触させることを含む、請求項１６に記載の方法。
前記試料は、尿試料である、請求項１６に記載の方法。
前記試料からの微生物細胞を前記固体増殖培地に播種する前に、微生物細胞を前記試料から分離し、且つ前記微生物細胞を再懸濁させて、微生物懸濁液を得ることを更に含み、前記試料からの前記微生物細胞を播種することは、前記微生物懸濁液を前記固体増殖培地と接触させることを含む、請求項１６に記載の方法。
前記試料は、全血を含み、前記試料から前記微生物細胞を分離することは、前記試料を、サポニン及びポリアネトールスルホン酸ナトリウムを含む血液溶解試薬と接触させ、且つアルカリ性緩衝液を用いて混合物を形成すること、前記混合物から微生物細胞を分離し、且つ前記微生物細胞を再懸濁させて、前記微生物懸濁液を得ることを含む、請求項１９に記載の方法。

Description

関連出願の相互参照本願は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、２０２３年４月２８日出願の「ＭＥＴＨＯＤＳＦＯＲＲＡＰＩＤＬＹＤＥＴＥＣＴＩＮＧＡＮＴＩＭＩＣＲＯＢＩＡＬＲＥＳＩＳＴＡＮＣＥＦＲＯＭＨＡＲＶＥＳＴＥＤＭＩＣＲＯＣＯＬＯＮＩＥＳ」という名称の米国仮特許出願第６３／４６２，８５７号明細書に対する優先権を主張し、且つその内容全体が参照により本明細書に援用される、２０２３年６月９日出願の「ＭＥＴＨＯＤＳＡＮＤＤＥＶＩＣＥＳＦＯＲＴＨＥＲＡＰＩＤＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮＡＮＤＤＥＴＥＣＴＩＯＮＯＦＭＩＣＲＯＢＩＡＬＣＥＬＬＳ」という名称の米国仮特許出願第６３／４７２，２２２号明細書に対する優先権を主張し、且つその内容全体が参照により本明細書に援用される、２０２３年９月１１日出願の「ＭＥＴＨＯＤＳＡＮＤＤＥＶＩＣＥＳＦＯＲＴＨＥＲＡＰＩＤＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮＡＮＤＤＥＴＥＣＴＩＯＮＯＦＭＩＣＲＯＢＩＡＬＣＥＬＬＳ」という名称の米国仮特許出願第６３／５３７，７３２号明細書に対する優先権を主張する。本開示は、微生物細胞の増殖、検出及び特性決定に関する。微生物感染の原因である生命体の同定及びその抗菌感受性プロファイルの測定は、臨床微生物学研究室における診断工程計画の主な目標である。一般的な慣習として、この作業は、現在、患者の血液を、抗生物質吸収剤を収容する培養ボトルに採血し、血液の微生物細胞内容物の増殖を促進する環境でボトルをインキュベートし、細胞壁の特徴及びモルホロジーの観点から細菌細胞を分類するためにグラム染色を実施し、純粋な微生物コロニーを得るために寒天平板などの固体増殖培地で細胞を継代培養し、微生物細胞を部分的又は完全に同定し、細胞濃度が所望の範囲に収まるようにコロニー内容物を培地で懸濁させ、細胞懸濁液のアリコートを、適切な培地において、選択された様々な用量の抗菌物質と接触させてインキュベートし、細胞アリコートの増殖プロファイルから最少阻害濃度（ＭＩＣ）を測定することとによって実施されている。この診断工程計画の主な欠点は、結果が出るまでに（数日規模で）時間がかかり、多菌性試料の場合に優先的増殖が起こり得ることである。試料から直接増殖したマイクロコロニーから微生物細胞を回収することと、回収された微生物細胞から放出された核酸で核酸増幅を実施することとに基づき、薬剤耐性マーカーを迅速に検出する例示的な方法を表すフローチャートである。試料から直接増殖したマイクロコロニーから回収された微生物細胞に基づき、核酸増幅アッセイパネルを迅速に実施する例示的な方法を表すフローチャートである。試料から直接増殖したマイクロコロニーから回収された微生物細胞に基づき、配列決定を迅速に実施する例示的な方法を表すフローチャートである。いくつかの微生物種に対する陽性までの平均時間及びマイクロコロニーの直径を表す。細胞懸濁液の拡張から４時間後にインキュベートしたマイクロコロニーから回収した細菌細胞の数を表す。各データポイントは、５つのマイクロコロニーにわたって平均されている。図４Ｂは、電気的引力及び斥力によってマイクロコロニー回収を実施する例示的な方法を概略的に表す。図４Ｃは、細胞懸濁液の拡張から４時間後、吸引及び電気回収法を用いて、インキュベートしたマイクロコロニーから回収した細菌細胞の数を表す。各データポイントは、５つのマイクロコロニーにわたって平均されている。様々な接着材料を有する親和性表面によって回収した、グラム染色した大腸菌ＡＴＣＣ３５２１８マイクロコロニー（４時間のインキュベーション）の画像を表す。様々な接着材料を有する親和性表面によって回収した、グラム染色した黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２５９２３マイクロコロニー（４時間のインキュベーション）の画像を表す。黄色ブドウ球菌及び大腸菌マイクロコロニーから回収した細胞懸濁液で実施した、ＲＴ－ＬＡＭＰアッセイの、陽性までの時間を表す。拡張後４時間増殖させた黄色ブドウ球菌及び大腸菌マイクロコロニーから回収した細胞懸濁液で実施したＲＴ－ＬＡＭＰアッセイの陽性までの時間を表す。拡張後４時間増殖させたマイクロコロニーから回収した細胞懸濁液で実施したＲＴ－ＬＡＭＰアッセイの陽性までの時間を表す。拡張後４時間増殖させたマイクロコロニーから回収した細胞懸濁液の２つのアリコートで実施したＲＴ－ＬＡＭＰアッセイの陽性までの時間を表す。１つのアリコートを熱溶解に通し、他のアリコートは、溶解なしで試験した。図１０Ａは、拡張後、４時間又は６時間増殖させた黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２９２２３コロニーから回収した細胞懸濁液で実施したＰＣＲアッセイにおけるＣＴ値を表す。図１０Ｂは、拡張後４時間増殖させた大腸菌及び黄色ブドウ球菌マイクロコロニーから回収した細胞懸濁液の２つのアリコートで実施したＰＣＲアッセイにおけるＣＴ値を比較する。図１１Ａは、５倍の無限平坦化対物レンズで直立鏡面反射（ｅｐｉ）明視野（ＢＦ）金属顕微鏡によってイメージングした血液寒天平板の切片を表す。サポニン及びポリアネトールスルホン酸ナトリウム（ＳＰＳ）で構成される血液溶解試薬で選択的に溶解させることで処理し、その後、２回の遠心分離洗浄サイクルを受けた全血から入手した１μＬの微生物細胞懸濁液をプレートに分配し、空気乾燥させた後、顕微鏡画像を入手した。試料が増殖した領域を３１２によって示す。図１１Ｂは、５倍の無限平坦化対物レンズで直立鏡面反射（ｅｐｉ）明視野（ＢＦ）金属顕微鏡によってイメージングした血液寒天平板の切片を表す。サポニン、ＳＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００及び炭酸塩－重炭酸塩緩衝液を含む血液溶解試薬で選択的に溶解させることで処理し、その後、２回の洗浄サイクルを受けた全血から入手した１μＬの微生物細胞懸濁液をプレートに分配し、空気乾燥させた後、顕微鏡画像を撮影した。図３Ｂを参照して記載する方法に従って試料を処理する際に用いた血液溶解試薬を使用して入手した血液デブリのサイズ分布を表す。サポニン、ＳＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００及び炭酸塩－重炭酸塩緩衝液を含む血液溶解試薬で選択的に溶解させることで処理し、その後、２又は４回の洗浄サイクルを受けた全血から入手した１μＬの微生物細胞懸濁液をプレートに分配し、空気乾燥させた後、１０倍の無限平坦化対物レンズにより、顕微鏡画像を撮影した。画像から粒子サイズ分布を分析し、粒子サイズ分布のヒストグラムを２回の洗浄サイクル（左）及び４回の洗浄サイクル（左）に対してプロットした。インキュベーションの０時間、２時間、３時間及び４時間後の時点で、５倍の無限平坦化対物レンズを備えた明視野（ＢＦ）金属顕微鏡によって撮像した、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（ＰＭ）でスパイクした全血試料を遠心分離によって分離することで入手した１μＬの微生物細胞懸濁液を分配した後、寒天平板で形成した微小培養物領域（ＭＣＲ）の切片を表す。矢印は、血液溶解デブリ及び目視によって識別可能なＰＭマイクロコロニーのいくつかを示す。タイムラプス画像解析により、血液溶解デブリから図６のＭＣＲで微生物コロニーを分化させる例示的なステップを表す。様々な時点（播種から０、２、３及び４時間後）に取得したイメージングデータを０時間の画像に対して空間上にアライン（登録）した後、０時間の画像を減算した。０時間の画像に存在する強度形質を背景（血液溶解デブリ）として分類した一方、減算した画像に現れる強度形質を前景マイクロコロニーとして分類した。図１４Ａは、遠心分離及びその後の寒天への播種によってスパイクした血液試料から回収したグラム陽性細菌の播種ＡＴＣＣ株の測定した増殖パラメーターを表す表である。増殖前のラグ時間、増殖率、陽性までの推定時間並びにマイクロコロニー内の多数の細胞が１０４及び１０５ＣＦＵに達するために要した平均時間を血液培養ボトル内の播種細胞増殖及び参照増殖（液体培養液）に対して表す。図１４Ｂは、遠心分離及びその後の寒天への播種によってスパイクした血液試料から回収したグラム陽性細菌の播種臨床分離物の測定した増殖パラメーターを表す表である。増殖前のラグ時間、増殖率、陽性までの推定時間並びにマイクロコロニー内の多数の細胞が１０４及び１０５ＣＦＵに達するために要した平均時間を血液培養ボトル内の播種細胞増殖及び参照増殖（液体培養液）に対して表す。図１４Ｃは、遠心分離及びその後の寒天への播種によってスパイクした血液試料から回収したグラム陽性細菌の更なる播種臨床分離物の測定した増殖パラメーターを表す表である。増殖前のラグ時間、増殖率、陽性までの推定時間並びにマイクロコロニー内の多数の細胞が１０４及び１０５ＣＦＵに達するために要した平均時間を血液培養ボトル内の播種細胞増殖及び参照増殖（液体培養液）に対して表す。図１４Ｄは、遠心分離及びその後の寒天への播種によってスパイクした血液試料から回収したグラム陰性細菌の播種ＡＴＣＣ株の測定した増殖パラメーターを表す表である。増殖前のラグ時間、増殖率、陽性までの推定時間並びにマイクロコロニー内の多数の細胞が１０４及び１０５ＣＦＵに達するために要した平均時間を血液培養ボトル内の播種細胞増殖及び参照増殖（液体培養液）に対して表す。図１４Ｅは、遠心分離及びその後の寒天への播種によってスパイクした血液試料から回収したグラム陰性細菌の播種臨床分離物の測定した増殖パラメーターを表す表である。増殖前のラグ時間、増殖率、陽性までの推定時間並びにマイクロコロニー内の多数の細胞が１０４及び１０５ＣＦＵに達するために要した平均時間を血液培養ボトル内の播種細胞増殖及び参照増殖（液体培養液）に対して表す。図１４Ｆは、遠心分離及びその後の寒天への播種によってスパイクした血液試料から回収したグラム陰性細菌の追加の播種臨床分離物の測定した増殖パラメーターを表す表である。増殖前のラグ時間、増殖率、陽性までの推定時間並びにマイクロコロニー内の多数の細胞が１０４及び１０５ＣＦＵに達するために要した平均時間を血液培養ボトル内の播種細胞増殖及び参照増殖（液体培養液）に対して表す。図１４Ｇは、遠心分離及びその後の寒天への播種によってスパイクした血液試料から回収した真菌細胞の播種ＡＴＣＣ株の測定した増殖パラメーターを表す表である。増殖前のラグ時間、増殖率、陽性までの推定時間並びにマイクロコロニー内の多数の細胞が１０４及び１０５ＣＦＵに達するために要した平均時間を血液培養ボトル内の播種細胞増殖及び参照増殖（液体培養液）に対して表す。図１４Ｈは、遠心分離及びその後の寒天への播種によってスパイクした血液試料から回収した真菌の播種臨床分離物の測定した増殖パラメーターを表す表である。増殖前のラグ時間、増殖率、陽性までの推定時間並びにマイクロコロニー内の多数の細胞が１０４及び１０５ＣＦＵに達するために要した平均時間を血液培養ボトル内の播種細胞増殖及び参照増殖（液体培養液）に対して表す。図１５Ａは、最終細胞懸濁液を播種し、３７℃で４時間インキュベートした後、異なる時点で、スパイクした全血試料から微生物細胞を遠心分離し、続いて寒天に播種した後に回収したＰＭ細菌細胞のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数をプロットする。図１５Ｂは、最終細胞懸濁液を播種し、３７℃で４時間インキュベートした後、異なる時点で、スパイクした全血試料から微生物細胞を遠心分離し、続いて寒天に播種した後に回収した表皮ブドウ球菌細菌細胞のＣＦＵの数をプロットする。図１５Ｃは、最終細胞懸濁液を播種し、３７℃で４時間インキュベートした後、異なる時点で、スパイクした全血試料から微生物細胞を遠心分離し、続いて寒天に播種した後に回収した緑膿菌細菌細胞のＣＦＵの数をプロットする。図１５Ｄは、