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JP-2026515056-A - 合成核酸及びその治療的使用

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Abstract

本発明は、５’－３’方向に、以下のエレメントを含む合成核酸に関する。 ａ）ヒトベータ－グロビン遺伝子の５’ＵＴＲ（配列番号４）、合成領域５’ＮｅｏＵＴＲ３（配列番号５）、ヒトアルファグロビン遺伝子の５’ＵＴＲ（配列番号６）、及び合成領域５’ＵＴＲ４（配列番号７）から選択される少なくとも１つの５’ＵＴＲ非翻訳領域、 ｂ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、及び ｃ）ロタウイルスのＶＰ６遺伝子（配列番号１）の３’ＵＴＲ領域及びマンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）遺伝子の３’ＵＴＲ領域から選択される少なくとも１つの３’ＵＴＲ非翻訳領域。

Inventors

  • ペルシュ，フェデリコ
  • メジュメジュ，アユーブ
  • ンガレ－ロス，アルベール

Assignees

  • センター ナショナル デ ラ レシェルシェ サイエンティフィーク

Dates

Publication Date
20260513
Application Date
20240502
Priority Date
20230505

Claims (12)

  1. ５’－３’方向に、以下のエレメント： ａ）ヒトベータ－グロビン遺伝子の５’ＵＴＲ（配列番号４）、合成エレメント５’ＮｅｏＵＴＲ３（配列番号５）、ヒトアルファグロビン遺伝子の５’ＵＴＲ（配列番号６）、及び合成エレメント５’ＵＴＲ４（配列番号７）から選択される少なくとも１つの５’ＵＴＲ非翻訳エレメントと、 ｂ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と、 ｃ）ロタウイルスＶＰ６遺伝子（配列番号１）の３’ＵＴＲエレメント及びマンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）遺伝子の３’ＵＴＲエレメントから選択される少なくとも１つの３’ＵＴＲ非翻訳エレメントと、を含む、合成核酸。
  2. 前記ＭｎＳＯＤ遺伝子の前記３’ＵＴＲエレメントが、ラット遺伝子（配列番号２）又はヒト遺伝子に由来することを特徴とする、請求項１に記載の合成核酸。
  3. 前記核酸が、ＲＮＡ、特にメッセンジャーＲＮＡであることを特徴とする、請求項１又は２のいずれか一項に記載の合成核酸。
  4. 前記核酸が、５’に、ＡＲＣＡ、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１又はＣａｐ２型のキャップを更に含むことを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の合成核酸。
  5. 前記核酸が、３’に、ポリ（Ａ）又はポリ（ＡＧ）テール、好ましくは少なくとも１つのＧヌクレオチド塩基を含むポリ（ＡＧ）テールを更に含むことを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の合成核酸。
  6. 前記ＯＲＦが、目的のタンパク質、すなわちＢＭＰタンパク質、好ましくはＢＭＰ２をコードすることを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の合成核酸。
  7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の合成核酸を含む、発現ベクター。
  8. ヒト胚性幹細胞を除いて、請求項１～６のいずれか一項に記載の合成核酸又は請求項７に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  9. 適切な医薬担体中の請求項１～６のいずれか一項に記載の合成核酸、並びに任意選択で１つ以上の賦形剤及び／又は１つ以上のアジュバントを含む、医薬組成物又はワクチン組成物。
  10. 薬物として使用するための請求項１～６のいずれか一項に記載の合成核酸。
  11. 骨の病状の治療又は予防に使用するための、請求項６に記載の合成核酸。
  12. 請求項８に記載の核酸が組み込まれた宿主細胞内で、前記核酸からの目的のタンパク質の翻訳を増加及び／又は延長するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の合成核酸のインビトロ使用。

Description

本発明は、核酸、特に治療目的のメッセンジャーＲＮＡの分野に関する。 遺伝子治療の概念は、分子生物学の発展と共に１９６０年代に現れた。遺伝子治療は、突然変異体、欠陥対立遺伝子により引き起こされる疾患を治療するために、生物の細胞中に核酸を送達することからなる戦略である。このアプローチは進化してきた。欠陥のある遺伝子活性を回復する戦略に加えて、現在では、治療的効果を有する可能性が高い、外因性核酸からの更なる活性の任意のインサイチュ産生にも関する。 治療分野で使用される核酸には、デオキシリボ核酸（deoxyribonucleic acid、ＤＮＡ ）（二本鎖と一本鎖）及びリボ核酸（ribonucleic acid、ＲＮＡ）（一本鎖、ＤＮＡ中にチミンではなくウラシルを含む）が含まれる。 その物理化学的及び生理学的特性のために、ＲＮＡは、目的の遺伝子を標的化するための、及び／又は外因性タンパク質の発現のための、特に強力な分子生物学ツールである。ＲＮＡ分解タンパク質に対するその不安定性及び感受性に関連する技術的障害は克服されており、今日、多数のＲＮＡ標的化及び／又はＲＮＡベースの治療製剤が承認されている。 総説（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０２２）は、以下の研究及びヒトの治療において使用される異なる型のＲＮＡを提示している。タンパク質へのＲＮＡの翻訳を特異的に抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡ分子の分解を引き起こす干渉ＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の「分子はさみ」として知られるエンドヌクレアーゼを、修飾される必要がある遺伝子に向けるガイドＲＮＡ、タンパク質と相互作用できるアプタマー、及びコードする遺伝情報をインサイチュでタンパク質に翻訳することを可能にするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）。 治療におけるｍＲＮＡの使用のためには、使用されるｍＲＮＡ分子の安定性を最適化して、その正確な細胞内在化及び翻訳を促進することが重要である。調整パラメータは、分子の化学組成（修飾ヌクレオチド、非翻訳配列の付加）、化学薬剤との可能な複合体化、及び投与製剤に使用される賦形剤である。 ２０２０年に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルス感染症に関連するＣＯＶＩＤ－１９疾患の出現は、ｍＲＮＡベースのワクチンの開発を加速させた。特に、Ｐｆｉｚｅｒ－ＢｉｏＮＴｅｃｈによって開発されたＢＮＴ１６２ｂ２ワクチン（Ｌａｍｂ，２０２１）、並びにモデルナのｍＲＮＡ－１２７３ワクチン（Ｂａｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０２１）は、それらの臨床的有効性を証明した。どちらのワクチンにも、コロナウイルススパイクタンパク質の融合前形態をコードする、修飾ヌクレオシドを含む合成ｍＲＮＡ分子を組み込んだイオン化脂質ベースの製剤が使用されている。 ｍＲＮＡワクチンはまた、癌治療のために開発されていて、２０を超えるワクチン候補が、現在、様々な固形腫瘍の治療のための臨床試験中である。ほとんどの場合、これらのｍＲＮＡワクチンは、免疫制御の調節因子又はサイトカインカクテルと同時に投与される。 治療用メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、配列最適化ｍＲＮＡの産生、及び適切な 細胞内在化のための化学薬剤とのその複合体化を必要とする高度な先進技術である。 真核細胞におけるｍＲＮＡ翻訳の従来のプロセスは、ｍＲＮＡを第１の開始コドンまでスキャンする、５’末端のキャップからのリボソームによるスキャニング機構に依拠している。ウイルスによって使用される別のプロセスは、いわゆるＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ、内部リボソーム進入部位）配列を伴い、キャップの存在及びスキャニング機構とは独立して、リボソームが開始コドンで動員されることを可能にする。 治療に使用される合成ｍＲＮＡは、通常、ポリ（Ａ）テール、すなわち、ＲＮＡ分子をＲＮＡ酵素による分解から保護する、コード配列の下流（３’）に位置する配列を備えている。 これらのエレメントに加えて、治療用ｍＲＮＡは、通常、コード配列の上流（５’ＵＴＲ）及び／又は下流（３’ＵＴＲ）に位置する非翻訳領域（Untranslated Regions、ＵＴＲ）と呼ばれる非翻訳ヌクレオチド配列を含む。形質転換細胞におけるｍＲＮＡタンパク質翻訳を延長及び／又は増加させるためのそのような５’及び／又は３’非翻訳配列の使用は、特に欧州特許第３４９４９８２号において提案されている。 （Ｕｃｈｉｄａｅｔ ａｌ．，２０２０）による総説は、合成ｍＲＮＡの翻訳効率及び半減期を増加させるためのこの戦略を提示しており、アルファグロビン、ベータグロビン、アルブミン、補体因子３、又はシトクロムＣＹＰ２Ｅ１の遺伝子などの、そのｍＲＮＡが高度に翻訳され、安定性を示す遺伝子に由来するＵＴＲ配列を含めることからなる。 これらの非翻訳配列は、特に以下を含む。 －論文（Ｂａｂｅｎｄｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，２００６）、国際公開第２０１４１８６３３４号及び欧州特許第０７３７７５０号に開示されているヒトベータグロビンの５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ配列。 －ヒトアルファグロビンＨＢＡ１又はＨＢＡ２遺伝子のうちの１つの５’ＵＴＲ配列（５’ＵＴＲ配列は、両方の遺伝子において同一である）。 －５’ＮｅｏＵＴＲ３エレメント、（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，２０２１）による論文及び米国特許出願公開第２０２０／００６６３７５号に開示されている合成エレメント。これは、機能評価後の１２，０００個の合成ＵＴＲのバンクから選択されるエレメントである。 －５’ＵＴＲ４エレメント、論文（Ｌｉｎａｒｅｓ－Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０２１）に記載されている合成エレメント。 －３’ｍｔＲＮＲ１ ＡＥＳ配列、一方はヒトミトコンドリア１２Ｓ ｒＲＮＡに由来し（ｍｔＲＮＲ１）、他方はヒトＡＥＳ／ＴＬＥ５遺伝子に由来する（ＡＥＳ）（Ｖｏｎ Ｎｉｅｓｓｅｎ Ａ ｅｔ ａｌ．，２０１９）２つのセグメントから構成される。 －ロタウイルスＶＰ６ウイルス遺伝子の３’ＵＴＲ配列、Ｙａｎｇら（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４）によって単離され、特徴付けられている。 －マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）をコードする遺伝子の３’ＵＴＲ配列、ｍＲＮＡ翻訳に対するその効果が（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８）による論文に開示されている。 これらの非翻訳エレメントは、特にワクチン組成物に使用されるｍＲＮＡに使用される。これは、特に、いわゆるＣＯＶＩＤ－１９疾患を誘発するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに対して開発されたワクチンの場合である。 特に、Ｐｆｉｚｅｒ及びＢｉｏＮＴｅｃｈ（Ｘｉａ，２０２１）によって開発されたＢ ＮＴ１６２ｂ２ワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の融合前バージョンをコードするオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ、ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含み、当該ＯＲＦは、以下のエレメントに隣接している。 －コザックコンセンサス配列がわずかに改変されているヒトアルファグロビン遺伝子の５’ＵＴＲ、及び －３’ＵＴＲ ｍｔＲＮＲ１ ＡＥＳ。 このワクチンで使用される５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲエレメントのこの特定の組み合わせは、このように構築されたｍＲＮＡの最大翻訳を可能にする参照組み合わせであると考えられる。 別の参照構築物は、ヒトベータグロビンの５’ＵＴＲエレメントとｍｔＲＮＲ１ ＡＥＳ ３’ＵＴＲエレメントとの会合である。 本発明者らは、ヒトベータグロビン遺伝子と３’ＵＴＲ ｍｔＲＮＲ１ ＡＥＳとの５’ＵＴＲの組み合わせについて観察されるものよりもはるかに高いレベルの翻訳を提供する、特に他の３’ＵＴＲエレメントを含む他の非翻訳エレメントを試験した。 更に、本発明者らは、本発明の合成核酸の安定性を増加させる、いくつかの型の異種ポリ（Ａ）－テール配列、特にポリ（ＡＧ）又はポリ（Ｇ）を試験した。 本発明は、５’－３’方向に、以下のエレメントを含む合成核酸に関する。 ａ）ヒトベータグロビン遺伝子の５’ＵＴＲ（配列番号４）、合成エレメント５’ＮｅｏＵＴＲ３（配列番号５）、ヒトアルファグロビン遺伝子の５’ＵＴＲ（配列番号６）、及び合成エレメント５’ＵＴＲ４（配列番号７）から選択される少なくとも１つの５’ＵＴＲ非翻訳エレメント、 ｂ）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、及び ｃ）ロタウイルスＶＰ６遺伝子（配列番号１）の３’ＵＴＲエレメント及びマンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）遺伝子の３’ＵＴＲエレメントから選択される少なくとも１つの３’ＵＴＲ非翻訳エレメント。 本発明はまた、上記のような合成核酸を含む発現ベクターに関する。 本発明はまた、ヒト胚性幹細胞を除く、上記のような合成核酸又は発現ベクターを含む宿主細胞に関する。 本発明の別の目的は、適切な医薬担体中に上記のような合成核酸、並びに任意選択で１つ以上の賦形剤及び／又は１つ以上のアジュバントを含む、医薬組成物又はワクチン組成物である。 本発明はまた、薬品として使用するための、上記のような合成核酸に関する。 本発明はまた、様々な用途、例えば骨障害の治療又は予防における使用のための、上記のような合成核酸に関する。 最後に、本発明はまた、上記で定義された当該核酸を組み込んだ宿主細胞内で、この核酸からの目的のタンパク質の翻訳を増加及び／又は延長するための、上記のような合成核酸のインビトロ使用に関する。 ３つの異なる細胞型に導入された、ＵＴＲの異なる組み合わせを有するナノルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡの発現動態を示す。 試験した組み合わせは以下のとおりである。 －５’β－３’ＭＴ＝５’ＵＴＲ＝ヒトベータグロビンの５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ ｍｔＲＮＲ１ ＡＥＳ －５’β－３’Ｒｏｔａ＝ヒトベータグロビンの５’ＵＴＲ及びロタウイルスＶＰ６遺伝子の３’ＵＴＲ －５’β－３’ＭｎＳＯＤ＝ヒトベータグロビンの５’ＵＴＲ及びラットＭｎＳＯＤ遺伝子の３’ＵＴＲ －５’ＮｅｏＵＴＲ３－３’ＭＴ＝合成エレメント５’ＮｅｏＵＴＲ３及び３’ＵＴＲ ｍｔＲＮＲ１ ＡＥＳ －５’ＮｅｏＵＴＲ３－３’Ｒｏｔａ＝合成エレメント５’ＮｅｏＵＴＲ３及びロタウイルスＶＰ６遺伝子の３’ＵＴＲ －５’ＮｅｏＵＴＲ３－３’ＭｎＳＯＤ＝合成エレメント５’ＮｅｏＵＴＲ３及びラットＭｎＳＯＤ遺伝子の３’ＵＴＲ ＨｅＬａヒト癌細胞における発現動態。３つの異なる細胞型に導入された、ＵＴＲの異なる組み合わせを有するナノルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡの発現動態を示す。 試験した組み合わせは以下のとおりである。 －５’β－３’ＭＴ＝５’ＵＴＲ＝ヒトベータグロビンの５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ ｍｔＲＮＲ１ ＡＥＳ －５’β－３’Ｒｏｔａ＝ヒトベータグロビンの５’ＵＴＲ及びロタウイルスＶＰ６遺伝子の３’ＵＴＲ －５’β－３’ＭｎＳＯＤ＝ヒトベータグロビンの５’ＵＴＲ及びラットＭｎＳＯＤ遺伝子の３’ＵＴＲ －５’ＮｅｏＵＴＲ３－３’ＭＴ＝合成エレメント５’ＮｅｏＵＴＲ３及び３’ＵＴＲ ｍｔＲＮＲ１ ＡＥＳ －５’ＮｅｏＵＴＲ３－３’Ｒｏｔａ＝合成エレメント５’ＮｅｏＵＴＲ３及びロタウイルスＶＰ６遺伝子の３’ＵＴＲ －５’ＮｅｏＵＴＲ３－３’ＭｎＳＯＤ＝合成エレメント５’ＮｅｏＵＴＲ３及びラットＭｎＳＯＤ遺伝子の３’ＵＴＲ ＤＣ２．４マウス樹状細胞における発現動態。３つの異なる細胞型に導入された、ＵＴＲの異なる組み合わせを有するナノルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡの発現動態を示す。 試験した組み合わせは以下のとおりである。 －５’β－３’ＭＴ＝５’ＵＴＲ＝ヒトベータグロビンの５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ ｍｔＲＮＲ１ ＡＥＳ －５’