Search

JP-2026515064-A - 細胞外マトリックスの遺伝子発現を増加させるのに有用なヒアルロン酸、アミノ酸およびクレブスサイクル中間体を含む組成物

JP2026515064AJP 2026515064 AJP2026515064 AJP 2026515064AJP-2026515064-A

Abstract

本発明は、アミノ酸の混合物、ヒアルロン酸またはその塩、ならびにクレブスサイクル酸、特にリンゴ酸およびコハク酸またはそれらの塩を含む、皮膚科および化粧品用途の組成物に関する。本発明の組成物は、細胞外マトリックスの沈着量の低下によって引き起こされる皮膚の老化を抑制するのに有用である。

Inventors

  • ジョルジェッティ、 パオロ

Assignees

  • プロフェスィオナル ディエテティクス ソシエタ ペル アチオニ

Dates

Publication Date
20260513
Application Date
20240507
Priority Date
20230510

Claims (9)

  1. 組成物であって、 ａ． グリシン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－バリン及びＬ－アラニンからなるアミノ酸混合物； ｂ． ヒアルロン酸またはその塩； ｃ． リンゴ酸、コハク酸またはそれらの薬学的に許容される塩、 を含む組成物。
  2. 前記アミノ酸混合物は、アミノ酸の重量比が以下の通りである、請求項１に記載の組成物。 － グリシン ：１； － Ｌ－プロリン ：０．７－０．８； － Ｌ－アラニン ：０．４７－０．７６； － Ｌ－バリン ：０．３５－０．５６； － Ｌ－ロイシン ：０．１３－０．２７； － Ｌ－リジン塩酸塩：０．１０－０．１２
  3. リンゴ酸とコハク酸の重量比が１：１である、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記アミノ酸混合物の重量パーセントが５～３０％である、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. リンゴ酸またはその薬学的に許容される塩の重量パーセントが１～５％である、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
  6. コハク酸またはその薬学的に許容される塩の重量パーセントが１～５％である、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
  7. 前記ヒアルロン酸またはその塩、特にヒアルロン酸ナトリウムが、５０，０００～２，５００，０００Ｄａの範囲の平均分子量を有し、その割合が組成物全体の１～５重量％である、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
  8. 注射用滅菌溶液または局所投与に適した形態の請求項１から７のいずれか１項に記載の組成物。
  9. 皮膚の老化を抑制し、及び予防するために、使用される請求項１から８のいずれか１項に記載の組成物。

Description

本発明は、ヒアルロン酸、アミノ酸またはその塩、およびクレブスサイクル酸、特にリンゴ酸およびコハク酸またはその塩の混合物を含む、皮膚科および化粧品に使用するための組成物に関する。本発明による組成物は、細胞外マトリックス沈着の低下によって引き起こされる皮膚の老化に対抗するのに有用である。 人体において、皮膚は加齢の影響を最も受ける器官の一つである。加齢に伴う細胞外マトリックス（ＥＣＭ）沈着の低下に対抗するために考案された栄養学的アプローチは、皮膚の老化の根底にある変性過程を軽減する有用な手段となり得る。 皮膚の老化は、皮膚の構造と機能の連続的かつ累積的な変化によって特徴づけられ、主にその細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の産生低下に起因する（Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｓｐａｒａｖｉｇｎａ，２０２０）。ＥＣＭ機能の低下は、皮膚の弾力性や復元力の低下、しわの出現を引き起こし、これは皮膚の老化の典型的な特徴である（Ｂｌａｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｓｐａｒａｖｉｇａ，２０２０，Ｂｉｒｃｈ，２０１８）。線維芽細胞は主にタンパク質とグリコサミノグリカンからなるＥＣＭを産生するが、その主要構成成分はヒアルロン酸（ＨＡ）であり、水分子と結合し保持する能力により、皮膚の保湿に関与する重要な分子である。加齢に伴う真皮のＨＡの含有量と活性の低下は、合成の低下と組織ヒアルロニダーゼ（ＨＡｓｅ）による分解の増加の両方から生じるため、皮膚の乾燥と保湿力の低下につながる（Ｐａｐａｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｓｃａｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。 ＥＣＭのタンパク質成分は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、およびラミニンなどの繊維状タンパク質で構成され、明確に規定されたアミノ酸（ＡＡ）組成を特徴とする。 エラスチン（ＥＬＮ）は皮膚の弾力性を担う主要なタンパク質で、真皮タンパク質全体の約２％を占める（Ｔｈｅｏｃｈａｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＥＬＮは、疎水性ドメインと親水性ドメインが交互に形成されてなる可溶性アイソフォームであるトロポエラスチンを介して合成される。疎水性ドメインは、グリシン、バリン、プロリン、およびアラニンなどの非極性ＡＡに富み、３～９個のＡＡが繰り返し配列している。一方、親水性ドメインは、アラニンおよびリシンに富んでいる。 フィブロネクチン（Ｆｂｎ）は細胞の結合、移動、接着に重要な役割を果たしている。したがってＦｂｎはそのタンパク質構造において様々な結合パターンを示し、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ、Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌ、およびＡｒｇ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｖａｌのような定義されたＡＡ配列によって特徴付けられ、Ｆｂｎ細胞の接着機能を媒介する（Ｒｏｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，２００４）。 コラーゲン（Ｃｏｌ）は哺乳類で最も豊富なタンパク質であり、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の主成分を占め、真皮では７５％に達する。Ｃｏｌは、グリシン－Ｘ－Ｙパターンを繰り返す剛直なＡＡ配列による分子結合に由来する三連らせん構造を持ち、グリシンが三連らせんを安定化し、ＸとＹはしばしばプロリンまたはヒドロキシプロリンである。したがって、ＥＬＮやＦｂｎと同様に、Ｃｏｌはグリシン、ヒドロキシプロリン、プロリン、およびアラニンの割合が高い特有のＡＡ組成を示す。コラーゲンファミリーはＩからＸＸＶＩＩＩまで２８のメンバーで構成されているが、同じタイプのコラーゲン内でも異なるアイソフォームが存在し、代替プロモーターや他のプロテアーゼによる切断の使用により、Ｃｏｌタンパク質ファミリーにはさらなる多様性が生じている（Ｖｕｏｒｉｏ ａｎｄ Ｄｅ Ｃｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ，１９９０；Ｌａｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ，２０１０；Ｃｈｕ，２０１１；Ｄａｌｔｏｎ ａｎｄ Ｌｅｍｍｏｎ，２０２１）。 ＥＣＭの構造成分の低下に加え、活性酸素種（ＲＯＳ）の過剰産生もまた、皮膚老化の重大な要因である。ハーマンの老化理論によると、このプロセスは主にミトコンドリア機能の低下に起因し、好気呼吸の副産物としてＲＯＳの発生が増加する。したがって酸化ストレスは、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を損傷し、酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）の機能不全を引き起こし、ＲＯＳの産生を増加させるＵＶによる皮膚の早期老化の主な原因である（Ｚｉａｄａ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。 現在、皮膚の老化を遅らせるために考案された方法は、過度の日焼けを避けること、および／または抗ＵＶクリームの使用といった予防的アプローチに基づいている（Ｍｏｈｉｕｄｄｉｎ，２０１９）。同時に、他の治療戦略では、ポリフェノール、植物抽出物、またはＨＡなどの天然化合物を補給することで、加齢に伴う皮膚の乾燥を抑制することが行われている。しかし、６種類のアミノ酸（グリシン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－バリン、およびＬ－アラニン）の混合物を線維芽細胞に添加すると、ＥＣＭの構成成分の発現が増加することが実証されている。さらに、前記６種類のアミノ酸は抗酸化遺伝子の発現を誘導する（Ｔｅｄｅｓｃｏ ｅｔ ａｌ．，２０２２年）。ＥＣＭのメカノトランスダクションと張力特性を維持する能力の根底にある、デ・ノボタンパク質合成とＥＣＭ構成成分の再構築と再生は、いずれもエネルギーコストが高く、ミトコンドリアＡＴＰ産生の増加が必要である（Ｒｏｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。したがって、ミトコンドリア活性を刺激することで、線維芽細胞におけるＥＣＭの沈着を促進し、皮膚の好気呼吸を改善することで、酸化ストレスによる皮膚の老化に対抗できる可能性がある。 グリシン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－バリンおよびＬ－アラニンからなる６種のアミノ酸の混合物を、ヒアルロン酸、リンゴ酸、コハク酸またはそれらの薬学的に許容される塩と組み合わせることにより、ＥＣＭ遺伝子の発現刺激に対して相乗効果を発揮することを見出した。したがって、本発明の目的は、前記アミノ酸をヒアルロン酸、リンゴ酸、およびコハク酸と組み合わせて含有する組成物であり、皮膚の老化に対抗するのに有用である。その目的のために、組成物は、すぐに使用できる滅菌溶液の形態で、または注射のために滅菌水で再溶解される凍結乾燥粉末として、注射により好適に投与することができる。組成物はまた、皮内充填剤として使用するためのゲル形態であり得る。あるいは、本発明による製剤は、例えば軟膏、ゲル、クリームなどの形態で、局所投与または経皮投与に使用することもできる。 アミノ酸の重量比は、コラーゲンやエラスチンに存在する比率に実質的に対応している。グリシンを基準とした相互比は以下の通りである。 － グリシン：１。 － Ｌ－プロリン：０．７－０．８％、好ましくは０．７５。 － Ｌ－アラニン：０．４７－０．７６、好ましくは０．４８－０．５１、より好ましくは０．７５－０．７６。 － Ｌ－バリン：０．３５－０．５６、好ましくは０．３５－０．３７または０．５４－０．５６。 － Ｌ－ロイシン０．１３－０．２７、好ましくは０．１３－０．１５。 － Ｌ－リジン塩酸塩：０．１０－０．１２、好ましくは０．１０－０．１１。 上記の比率のアミノ酸の混合物は、本発明による組成物中に、５から３０重量％、好ましくは５から１５重量％の範囲の濃度で存在する。 リンゴ酸およびコハク酸の重量比は、好ましくは約１：１である。リンゴ酸およびコハク酸またはその塩は、好ましくは１から５重量％の濃度で存在する。 ヒアルロン酸またはその塩、特にヒアルロン酸ナトリウムは、好ましくは５０，０００から２，５００，０００Ｄａの範囲の平均分子量Ｍｎを有する。ヒアルロン酸またはヒアルロン酸ナトリウムの割合は、組成物全体の１から５重量％の範囲である。 想定される皮膚科的、化粧品的または治療的用途のために、本発明による組成物は、適用部位および治療または予防の対象となる状態に応じて、０．１から１０ｍｌの範囲の量で皮下または皮内に投与される。局所投与の場合、製剤は０．１から１０ｇの範囲の量で適用することができる。 本発明を以下の実施例で詳細に説明する。 実施例1 実施例2 実施例３ 実施例４ 薬理学的実験 実施された最も重要な実験を例として説明する。特に、ＨＡで富化した６アミノ酸混合物（６ＡＡＨ）に、コハク酸塩（６ＡＡＨＳ）、リンゴ酸塩（６ＡＡＨＭ）またはコハク酸塩／リンゴ酸塩（６ＡＡＨＳＭ）を添加したものが、ヒト線維芽細胞におけるＥＣＭ遺伝子発現に及ぼす影響を、基礎条件下と酸化ストレス（過酸化水素）応答の両方で検討した。 ＢＪヒト線維芽細胞に６ＡＡＨ、６ＡＡＨＳ、６ＡＡＨＭおよび６ＡＡＨＳＭを添加し、種々のＥＣＭマーカーのｍＲＮＡレベルを評価した。６ＡＡＨＳＭは、単独あるいはコハク酸またはリンゴ酸のみを添加した６ＡＡＨよりも、すべてのＥＣＭマーカーの発現を有意に増加させた。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ酸化ストレスモデルにおいて、６ＡＡＨＳＭは過酸化水素によって誘導されるＥＣＭ遺伝子発現の低下を抑制した。このデータから、リンゴ酸やコハク酸を豊富に含む６ＡＡＨを食事で補給することは、皮膚の老化に対抗する非薬理学的アプローチとして有用であることが示唆される。 材料と方法 細胞培養と処理 ＢＪヒト皮膚線維芽細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２５２２（商標））を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および抗生物質を添加したＥＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中、標準条件下で培養した。細胞培養は３７℃、湿度９５％、およびＣＯ２ ５％で行った。細胞は０．１％（Ｗ／Ｖ）の混合物（組成は表１に示す）、＋／－リンゴ酸およびコハク酸（各５ｍＭ）で３日間処理した。未処理の細胞はコントロールとして播種した。２４時間ごとに、対照フラスコと処理フラスコの両方で、培地を新鮮な培地またはアミノ酸の混合物に交換した。培養培地のみ、又は選択された混合物（図3）で２４時間前処理した細胞において、過酸化水素による酸化ストレスを実施した。次いで、Ｈ２Ｏ２（５００μＭ）を２時間添加し、実験処理の最後に、ｍＲＮＡ抽出のために細胞を回収した。 ＲＮＡ抽出と定量的ＲＴ－ＰＣＲ ｍＲＮＡレベル解析のために、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）で単離した１μｇの総ＲＮＡをｃＤＮＡ ｉＳｃｒｉｐｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，イタリア）で逆転写した。ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、三連のＰＣＲ反応を行った。対応する遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨを用いた比較法（２－ΔΔＣｔ）で算出した。プライマー配列はＢｅａｃｏｎ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ ２．６ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｂｉｏｓｏｆｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，米国）を用いて設計した。 タンパク質抽出とウェスタンブロット法 全タンパク質はＭ－ＰＥＲ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ；ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて抽出した。タンパク質含量は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）で測定した。３０－４０μｇのタンパク質を、４－２０％濃度勾配のドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドＴＧＸゲル（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）（ＢｉｏＲａｄ）で分析した。ゲルをＰＶＤＦに移し、５％脱脂粉乳でブロックし、抗Ｆｂｎ１（１：１０００、ＧｅｎｅＴｅｘ、Ｃａｔ＃ＧＴＸ１１２７９４）または抗ビンキュリン（１：１０００、Ｃａｔ＃Ｖ９１３１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でインキュベートした。 リンゴ酸