Search

KR-102959136-B1 - Color-Encoded Hydrogel Particle and Composition for Multiplexing Detection Comprising the Particle

KR102959136B1KR 102959136 B1KR102959136 B1KR 102959136B1KR-102959136-B1

Abstract

본 발명은 간편하게 제조할 수 있으며 수많은 조합이 가능하여 현탁 어레이에 의한 생체물질의 다중 검출에 유용하게 사용될 수 있는 색상-인코딩된 하이드로겔 입자와, 이를 포함하는 생체물질 다중 검출용 조성물 및 생체 물질 다중 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 코어-쉘 구조를 갖는 미소구체인 하이드로겔 입자로서, 코어 하이드로겔은 안료를 포함하여 색상에 의해 입자를 인코딩하고, 쉘 하이드로겔은 검출 표적과 특이적으로 결합하는 프로브를 포함하는, 생체물질 검출 또는 분석을 위한, 색상-인코딩된 하이드로겔 입자와, 이를 포함하는 생체물질 다중 검출용 조성물 및 생체 물질 다중 검출 방법에 관한 것이다.

Inventors

  • 최창형
  • 박종필
  • 김지현
  • 김지홍

Assignees

  • 영남대학교 산학협력단
  • 중앙대학교 산학협력단

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20240605

Claims (11)

  1. 코어-쉘 구조를 갖는 미소구체인 하이드로겔 입자로서, 코어 하이드로겔은 안료를 포함하여 색상에 의해 입자를 인코딩하고, 쉘 하이드로겔은 검출 표적과 특이적으로 결합하는 프로브를 포함하는, 생체물질 검출 또는 분석을 위한, 색상-인코딩된 하이드로겔 입자.
  2. 청구항 1에 있어서, 코어의 직경, 쉘의 두께, 전체 입자의 직경 중 적어도 하나 이상의 크기에 의해 추가적으로 인코딩되는, 색상-인코딩된 하이드로겔 입자.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 코어-쉘 하이드로겔 입자는, (A) 안료와 코어 하이드로겔 프로폴리머 수용액을 포함하는 코어 액적과 쉘 하이드로겔 프로폴리머 수용액을 포함하는 쉘 액적 사이에 오일층을 포함하는 삼중 에멀젼 액적을 형성하는 단계; (B) 상기 삼중 에멀젼 액적에서 코어 하이드로겔 프로폴리머와 쉘 하이드로겔 프로폴리머를 중합하여 코어 하이드로겔-오일층-쉘 하이드로겔로 이루어진 하이드로겔 미소구체를 형성하는 단계; 및 (C) 상기 하이드로겔 미소구체로부터 오일층을 제거하는 단계; 를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 색상-인코딩된 하이드로겔 입자.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 쉘 하이드로겔은 카르복실기, 아민기, 티올기 및 하이드록시기로부터 선택되는 하나 이상의 반응성 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 색상-인코딩된 하이드로겔 입자.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 반응성 작용기는 쉘 하이드로겔 프로폴리머 유래인 것을 특징으로 하는, 색상-인코딩된 하이드로겔 입자.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 작용기는 쉘 하이드로겔 프로폴리머에 혼합된 첨가제 유래인 것을 특징으로 하는, 색상-인코딩된 하이드로겔 입자.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 첨가제는 키토산 또는 폴리아크릴산인 것을 특징으로 하는, 색상-인코딩된 하이드로겔 입자.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브는 DNA, RNA, 압타머, 단백질, 펩타이드 및 탄수화물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 색상-인코딩된 하이드로겔 입자.
  9. 표적 물질에 따라 인코딩이 상이한 복수종의 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항의 색상-인코딩된 하이드로겔 입자를 포함하는, 생체물질 다중 검출용 조성물.
  10. 청구항 9의 조성물을 이용한 생체물질 다중 검출 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 표적 생체물질이 표지되어 있는 것을 특징으로 하는 생체물질 다중 검출 방법.

Description

색상-인코딩된 하이드로겔 입자 및 이를 포함하는 생체물질 다중 검출용 조성물{Color-Encoded Hydrogel Particle and Composition for Multiplexing Detection Comprising the Particle} 본 발명은 간편하게 제조할 수 있으며 수많은 조합이 가능하여 현탁 어레이에 의한 생체물질의 다중 검출에 유용하게 사용될 수 있는 색상-인코딩된 하이드로겔 입자와, 이를 포함하는 생체물질 다중 검출용 조성물 및 생체 물질 다중 검출 방법에 관한 것이다. 현탁 어레이(suspension array)에 의하면 반응할 수 있는 표면적이 넓고 결합이 빠르기 때문에 통계적 검정력이 우수하고 비용을 절감할 수 있어, 2D 평면 어레이에 비해 생물학적 스크리닝이나, 멀티플렉스 생물학적 분석에서 특히 유리하다. 공간에서 위치정보로 구분하는 평면 어레이와 달리 현탁 어레이에서는 시료로부터 상이한 분석물의 다중화된 검출 및 정량화를 위해 미세입자(microparticle)에 고유한 식별 태그를 인코딩하여 사용한다. 여기에서, "인코딩(encoding)"이란 광학적 특성을 측정하거나, 현미경 기술을 통해 구별할 수 있는 입자의 크기나 모양과 같은 개별 입자의 고유한 특징을 의미한다. 다수의 분석물의 측정을 위해, 상이한 인코딩된 입자가 혼합물에 사용되며 인코딩에 의해 분석과정에서 효율적인 분류와 동시 다중 표적 분석이 가능하므로, 인코딩된 입자를 이용한 현탁 어레이는 분석 효율성과 유연성이 모두 향상된다. 특히, 3차원 다공성 구조를 갖는 하이드로겔 기반 현탁 어레이는 분자 결합 및 상호 작용을 크게 향상시켜 분석 감도와 특이성을 증가시킨다. 하이드로겔의 화학적 다양성은 특이적인 생체 분자 상호 작용 맞춤화를 가능하게 하므로 광범위한 바이오센싱 응용 분야에 이상적이다. 최근 미세가공 기술의 발전으로 하이드로겔 미세입자의 모양, 크기, 화학적 기능성 및 다공성 등을 정밀하게 제어하여 안정적으로 제조할 수 있다. 배치-기반 포토리소그래피(batch-based photolithography) 및 미세몰딩(micromolding)과 같은 기술을 통해 비구형 미세입자의 크기와 모양을 정밀하게 제어할 수 있으며, 각 하이드로겔 입자에 서로 다른 생체 분자를 접합하여 그래픽 인코딩(즉, 형상 기반 인코딩)을 하는 것이 가능하다. 플로우 리소그래피(flow lithography)는 미세유체 채널을 흐르는 액체의 흐름을 이용한 것으로, 균일한 크기와 모양의 구형/비구형 하이드로겔 입자를 빠르게 생성할 수 있다. 생성된 하이드로겔 입자를 활용하면 많은 종류의 그래픽 인코딩이 가능하다. 그래픽 인코딩된 미세입자는 공간적 배열에 따라 2D 투영 모양이 달라지기 때문에 입자를 정확하게 식별하기 위해서는 입자 정렬을 위한 추가 장치와 복잡한 절차가 필요하다. 분광 인코딩은 인코딩의 또 다른 방식으로 입자에 특정 광학특성을 부여하여 정보를 인코딩하는 방식이다. 이 방법은 색상에 기반하는 경우 별도의 장치 없이도 육안으로 쉽게 바코드를 식별할 수 있는 이점이 있다. 그러나 구별 가능한 스펙트럼의 범위와 해상도로 인해 인코딩할 수 있는 정보의 양이 제한될 수 있다. 또한 pH나 온도 등 화학적/물리적 요인에 의해 인코딩에 사용된 염료의 색상이 변하거나 주변 빛의 간섭으로 인해 신호가 왜곡되는 경우 인코딩된 정보의 정확성에 영향을 줄 수 있어 신뢰할 수 있는 생물학적 분석 수행에 장애가 된다. 형광에 기반하는 경우에는 특정한 감지 장치를 필요로 하여, 모든 환경이나 상황에서 즉각적으로 사용할 수 없다는 제한이 있다. 분광 및 그래픽 인코딩을 결합하면 가능한 바코드의 수를 크게 늘릴 수 있다. 그러나 이러한 목적으로 설계된 대부분의 시스템은 하이드로겔 입자로 사용이 제한되며, 생체분자와 효율적으로 상호작용하기 위하여 특정 화학적 기능을 갖춰야 한다. 이를 위해 예를 들어, 항체와의 결합과 같은 생체 분자 접합을 위한 추가적인 표면 처리 공정이 필요하여, 제조 과정을 복잡하게 만든다. 이러한 문제를 해결하려면 하이드로겔의 표면 처리를 최소화 하면서도 생체분자와 효율적으로 상호작용할 수 있으면서, 공간적 배치와 관계 없이 일관된 바코드 인식이 가능한 현탁 어레이 시스템이 필요하다. 도 1은 다중구획 하이드로겔(MH) 미소구체의 제조를 위한 3중 에멀젼 제조 장치 및 MH 미소구체 전구체의 제조 공정을 보여주는 모식도. 도 2는 MH 미소구체 전구체로부터 코어-쉘 구조의 MH 미소구체를 형성하는 과정을 보여주는 개요도 및 현미경 사진. 도 3은 다양한 색상으로 색상-인코딩된 하이드로겔 입자의 현미경 사진. 도 4는 MH 미소구체의 쉘 구획에 형광분자를 컨쥬게이션 하는 반응을 보여주는 개략도 및 결과 현미경 이미지. 도 5는 형광분자의 농도에 따른 하이드로겔 입자의 형광강도를 보여주는 이미지 및 그래프. 도 6은 형광분자와의 반응 시간에 따른 하이드로겔 입자의 형광강도를 보여주는 이미지 및 그래프. 도 7은 쉘에 서로 다른 수식기를 갖는 미소구체를 다른 형광분자에 의해 one-pot 컨쥬게이션 하는 것을 보여주는 모식도 및 결과의 형광 이미지. 도 8은 일 실시예에 따른 인플루엔자 바이러스 항원 친화성 펩타이드의 고정화 과정을 보여주는 개략도. 도 9는 인플루엔자 바이러스 항원 결합 시 미소구체에 고정화된 펩타이드 농도에 따른 형광강도를 보여주는 그래프 및 이미지. 도 10은 색상 인코딩 MH 미소구체를 이용한 다중 검출을 보여주는 예시적 모식도 및 이미지. 이하 첨부된 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 도면과 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다. 실시예 1: 인코딩된 다중구획 하이드로겔(MH) 미소구체의 제조 중간층으로 얇은 오일층이 있는 삼중 에멀젼 액정에서 오일층을 희생층으로 사용하여 색상 인코딩된 다중구획 하이드로겔(MH) 미소구체를 제조하였다. 도 1은 다중구획 하이드로겔(MH) 미소구체의 제조를 위한 3중 에멀젼 제조 장치 및 MH 미소구체 전구체의 제조 공정을 보여주는 모식도로, 이를 위하여 3개의 원형 모세관을 정사각 모세관에 조립하여 다음과 같은 방법에 의해 미세유체장치를 제조하였다. 100 μm 주입구 직경을 갖는 주입 모세관을 제작하기 위해, 외경이 1.0 mm인 원형 유리 모세관(1B100-6, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)을 마이크로피펫 풀러(P-97, Sutter Instrument, Novato, CA, USA)를 사용하여 테이퍼 형태로 성형하였다. 성형된 모세관의 내부를 n-옥타데실트리메톡시실란으로 15분 동안 처리하여 모세관 내부표면을 소수성으로 만들고, 외부는 2-[메톡시(폴리에틸렌옥시)프로필] 트리메톡시 실란으로 처리하여 친수성으로 만들었다. 350μm 직경을 갖는 수집 모세관을 제작하기 위해, 위 방법과 동일하게 원형 유리 모세관을 성형하였다. 성형된 모세관의 내외부를 모두 n-옥타데실트리메톡시실란으로 15분간 처리하여 소수성으로 만들었다. 이후 실란으로 처리된 주입 모세관과 수집 모세관을 에탄올 및 이소프로필 알코올로 세척하여 과량의 실란을 제거하였다. 내폭이 1.05 mm인 정사각 모세관을 준비하고, 위에서 준비한 주입 모세관을 정사각 모세관에 삽입하였다. 내경이 50 μm인 테이퍼 모세관을 알코올 불꽃을 사용하여 수작업으로 제작한 다음 수성 프로폴리머 용액을 전달하기 위해 주입 모세관 내에 삽입하였다. 주입 모세관이 삽입된 정사각 모세관의 반대쪽 말단에 내부와 외부가 모두 소수성으로 개질된 수집 모세관을 주입 모세관과 동축을 유지하도록 정렬하여 도입하였다. 수집 모세관의 말단에는 배출되는 미소구를 수집하기 위해 마이크로튜브를 연결하였다. 이후 시린지 펌프(KD Scientific Inc., LEGATO 100, Holliston, MA, USA)를 사용하여, 각 모세관으로 시료를 주입하였다. 구체적으로, 10% (v/v) 폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트(PEGDA, Mn 700 Da, Sigma-Aldrich), 1% (v/v) 폴리(비닐 알코올)(PVA, 87~89% 가수분해, Sigma-Aldrich), 1% (v/v) 광개시제(PI) 및 0.025% (v/v) 안료로 구성된 수용성 하이드로겔 전구체(I.M으로 약칭) 용액을 50 μm 직경의 테이퍼 모세관을 통해 주입하여 가장 안쪽 액적을 형성하였다. 오일상(2% (v/v) ABIL® EM90, I을 함유한 n-헥사데칸)을 주입 모세관을 통해 주입하여 테이퍼 모세관으로 주입되는 수용액 액적을 형성시켰다. 이후 쉘 하이드로겔의 전구체인 10% (v/v) PEGDA, 1% (v/v) F108, 2% (v/v) PVA, 0.1% (w/v) 키토산(CS, 평균 Mn 5kDa, >90% 디아세틸화, Sigma-Aldrich)(또는 0.2% (v/v) 폴리아크릴산(PAA, 평균 Mn ~4,000,000, Sigma-Aldrich)) 및 1% (v/v) PI를 함유하는 하이드로겔 전구체 용액(M)을 주입 모세관과 사각 모세관 사이의 틈새를 통해 추가로 주입하여 얇은 오일층을 중간층으로 하는 삼중 에멀젼 액적을 연속적으로 형성하였다. 삼중 에멀젼 액적은 수집 모세관에 연결된 마이크로튜브를 통과하는 동안 자외선을 조사하여 하이드로겔 프로폴리머가 광중합되도록 하였다. 상기 공정 및 이후 공정에서 생성된 에멀젼 액적 및 하이드로겔 미소구체를 고속 카메라(Photron USA Inc., MINI UX 50, San Diego, CA, USA)가 장착된 도립 현미경(inverted microscope, Eclipse Ts2, Nikon, Japan)으로 관찰하였다. 도 2는 위 과정을 통해 제조된 MH 미소구체 전구체와 그로부터 코어-쉘 구조의 MH 미소구체를 형성하는 과정을 보여주는 개요도 및 해당 현미경 사진이다. 이하 실시예에서, 현미