Search

KR-102959268-B1 - Composition for enhancing intracellular calcium comprising Peucedanum japonicum extract

KR102959268B1KR 102959268 B1KR102959268 B1KR 102959268B1KR-102959268-B1

Abstract

본 발명은 식방풍 ( Peucedanum japonicum ) 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 세포 내 칼슘 증강용 조성물에 관한 것이다. 상기 추출물은 세포 내 칼슘의 증강 효능을 유도하여 암 악액질 상태의 세포 또는 노화된 세포간의 위축을 유도하는 FoxO3a, MuRF1, MAFbx, Myostatin의 발현을 억제한다. 또한 세포 내 단백질 생산을 자극하는 Akt, mTOR, S6K, AMPK, ERK를 활성화하는 역할을 한다. 이로 인해 식방풍 추출물이 손상된 체세포의 상태를 정상 상태로 회복함으로 인해 각종 근골격계 질환, 암 질환, 칼슘의 저하로 인해 발생하는 신경계 질환을 대상으로 하는 식품 또는 약학 조성물로의 적용 가능함을 확인할 수 있다.

Inventors

  • 김현수
  • 황재삼
  • 양태진
  • 박지영
  • 김진태

Assignees

  • 마이오텍사이언스 주식회사
  • 서울대학교산학협력단

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20250613

Claims (7)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 식방풍 ( Peucedanum japonicum ) 잎의 물 추출물을 함유하는 근육세포 내 칼슘 증강용 건강기능식품으로서, 상기 추출물은, 식방풍 잎에 물 5~40배 중량을 넣고 80~95℃에서 3~8시간 추출하여 수득한 것이고, 상기 추출물 300㎍/㎖에서 근육세포 내 칼슘이 3.0~4.0배 증가하며, 상기 추출물이, Akt (protein kinase B, PKB), mTOR (mammalian target of rapamycin), S6K (ribosomal protein S6 kinase 1), AMPK (adenosine monophosphate-activated protein kinase) 또는 ERK (extracellular signal-regulated kinase)의 활성화를 유도하거나, 상기 추출물이, 노화 유발원, 암 악액질 유발원 또는 염증 유발원으로 인해 세포 손상 및 위축이 유도된 근육 세포의 마이오스타틴(myostatin)의 단백질 또는 이의 유전자 발현을 억제하는 효능이 있는 것을 특징으로 하는 근육세포 내 칼슘 증강용 건강기능식품.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제4항에 있어서, 상기 추출물은 FoxO3a (forkhead box O3a), MuRF1 (muscle ring-finger protein 1) 또는 MAFbx (muscle atrophy F-box, atrogin-1)의 단백질 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 근육세포 내 칼슘 증강용 건강기능식품.

Description

식방풍 추출물을 함유하는 세포 내 칼슘 증강용 조성물 {Composition for enhancing intracellular calcium comprising Peucedanum japonicum extract} 본 발명은 식방풍 (Peucedanum japonicum) 추출물을 함유하는 세포 내 칼슘 증강용 조성물에 관한 것이다. 세포 내 칼슘 농도는 다양한 생리활성 신호전달 경로에 영향을 미치며, TGF-β 슈퍼패밀리 (transforming growth factor-β superfamily) 계열의 성장인자 경로와도 상호작용한다. TGF-β에 의해 유도되는 Smad2/3 경로는 세포 성장 억제 및 세포사멸을 매개하며, 특히 세포주기 억제 단백질인 p21의 발현을 유도함으로써 세포의 증식을 억제하는 기전과 관련된다. 반면, 세포 내 칼슘 농도의 증가 또는 그로 인해 유도되는 phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K)/Akt pathway/mammalian target of rapamycin (mTOR) 경로의 활성화는 세포 내 단백질 합성과 생합성을 촉진하며, 이는 IGF-1 (Insulin-like Growth Factor-1) 및 Follistatin 등의 발현 증가와도 연계되어 성장 억제 신호에 대항하는 세포 내 환경 조성에 기여한다. Follistatin은 TGF-β 경로에 속하는 마이오스타틴이나 액티빈 등의 활성을 중화하는 단백질로 알려져 있으며, 세포 분화 및 생존에 긍정적 영향을 미친다. 한편, 세포 내에서 PI3K/Akt pathway의 자극을 통해 하위 단백질의 인산화가 유도되는데, 이 중, mammalian target of rapamycin (mTOR)의 활성이 중심 인자로서, 다양한 세포 내 단백질 합성을 유도하여 이를 활성화한다. mTOR의 증가는 ribosomal protein S6 kinase 1 (S6K1, p70S6K)을 인산화하여 활성화시키며, mRNA 번역을 촉진하고 리보솜 생성을 증가시키고, AMP-activated protein kinase (AMPK)는 PGC-1α(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α)를 통해 미토콘드리아 생성을 촉진하고, 장기적으로 세포 내 대사를 개선한다. 또한 ERK(extracellular signal-regulated kinase)는 mTOR와 S6K 신호를 강화하여 세포의 분화 및 증식을 촉진하는 데 기여한다. 이러한 기작은 세포의 손상, 노화, 암 등의로의 불가역적 변화로부터 세포를 보호하는 역할을 하게 된다. 식방풍 (Peucedanum japonicum) 은 주로 제주도, 남해안 등에 자생하며, 방풍이나 해방풍, 갯방풍과 명칭이 비슷하기는 하지만 이들은 내륙의 중북부나 중부, 내륙의 해안 등에서 발견되며, 식물의 학명 상으로도 속명부터 다른 식물이다. 전통적으로도 식방풍은 식용하거나 두통, 감기, 근육통 등의 염증 해소용 약재로 사용되었으며, 방풍은 주로 해열 진통용 약재로 쓰였으며, 해방풍은 식용하는 데에 이용되었으며 갯방풍은 진해거담제로 사용되었다. 이에 본 발명자들은 식방풍과 같은 천연물 추출물에 대한 약리학적 활성을 확인하던 중, 상기 추출물이 세포 내 칼슘 농도를 증강시키는 효능이 우수하여 각종 세포 내 생리활성을 활성화함을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다. 도 1은 식방풍 추출물을 C2C12 세포에 처리하였을 때 24시간 동안 처리하였을 때의 세포 독성을 확인한 결과다. 도 2는 C2C12 세포에 식방풍 추출물을 처리하였을 때 칼슘의 농도가 증가한 것을 확인한 결과다. 도 3은 분화된 C2C12 세포에 식방풍 추출물을 처리하였을 때 세포 성장과 관련된 신호전달 인자인 Akt, mTOR, S6K, AMPK 및 ERK의 인산화 반응을 확인한 결과다. 도 4는 세포노화 유도 물질 처리로 인해 손상된 C2C12 세포에 식방풍 추출물을 처리하였을 때의 Myostatin 프로모터 활성 억제 효과를 확인한 결과다. 도 5는 염증성 사이토카인 처리를 통해 손상된 C2C12 세포에 식방풍 추출물을 처리하였을 때의 Myostatin 프로모터 활성 억제 효과를 확인한 결과다. 도 6은 암 악액질 유도로 인해 손상된 분화 C2C12 세포에 식방풍 추출물을 처리하였을 때의 FoxO3a, MuRF1, MAFbx 및 Myostatin의 단백질 발현을 확인한 결과다. 도 7은 세포노화 유도 물질 처리로 인해 손상된 분화 C2C12 세포에 식방풍 추출물을 처리하였을 때의 Myostatin 유전자 발현 억제 효과를 확인한 결과다. 이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다. <실시예 1. 식방풍 추출물의 제조> 식방풍 (Peucedanum japonicum) 잎 100g을 물 2kg에 첨가하고 90℃에서 4시간 동안 추출한 후 얻은 액상을 동결건조하여 식방풍 추출물을 수득하였다. <실시예 2. 세포 독성 확인> 분화되지 않은 상태에 있는 마우스 골격근 세포인 C2C12 세포를 ATCC에서 구입하여 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)에 10% FBS(fatal bovine serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Penicillin/streptomycin, P/S) 존재 하에 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 세포독성을 확인하기 위해, C2C12를 96 well-plate에 1×106/well로 분주하고, 24시간 동안 배양하였다. 이 후, 식방풍 추출물을 최종농도가 3000㎍/㎖이 되도록 각각 24시간 동안 처리하였다. 이 후, 1 mg/mL 농도의 MTT(tetrazoliumsalt [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyltetrazolium bromide]) 시약을 배지에 첨가하여 2시간 동안 배양 후, 상층액을 제거하고 DMSO(dimethyl sulfoxide)로 Formazan을 용해하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 도 1과 같이 식방풍 추출물을 처리하였을 때 세포독성이 전혀 나타나지 않았고, 3000㎍/㎖에서는 무처리군과 비교하여 세포 재생/증식도 나타났다. <실시예 3. 세포 내의 칼슘 농도 확인> Calcium fluoresence를 측정하기 위해 C2C12 세포를 12 well-plate에 1×106/well로 분주하고, 24시간 동안 배양하였다. 이 후 측정 30분 전 배양액을 serum-free media로 교체하고 1 μM Fluo-3를 처리한 뒤 30분 후, PBS로 2회 세척 후 Serum-freemedia로 배양액을 교체하였다. Acetylcholine 100 μM 또는 식방풍 추출물 300㎍/㎖을 각 세포에 처리한 후, 공초점 현미경을 사용하여 실시간 세포 내 형광 수준을 관찰하였고 ImageJ로 이를 환산하였다. 그 결과, 표 1 및 도 2과 같이 아세틸콜린 처리군과 유사하게, 식방풍 추출물군에서도 칼슘 반응이 증가한 것을 관찰할 수 있다. 시료추출물 처리 전 - Before (fold)추출물 처리 후 - After (fold)식방풍 추출물 300㎍/㎖ 1.003.45 칼슘은 세포 내에서 2차 신호전달 인자(second messenger)로 작용하며, 운동, 신경 신호, 대사 과정과 연결되어 있다. 또한 세포 성장의 주요 요인이 된다. 이에 식방풍 추출물이 세포의 성장 및 단백질 합성에 유용함을 확인할 수 있다. <실시예 4. 식방풍 추출물의 세포 성장 관련 인자의 활성화 확인> 식방풍 추출물이 세포 분화 및 성장 관련 인자인 Akt, mTOR, S6K, AMPK, ERK의 인산화에 영향을 주는지를 확인하였다. 6 well-plate에 1×105/well로 분주하여 10% FBS가 포함된 DMEM에 배양하던 C2C12를 2%의 HS(horse serum)이 포함된 DMEM으로 변경하여 5일간 배양하여 세포 분화를 유도하였다. 이후, 분화된 세포에서 인산화를 유도하기 위해, FBS가 없는 DMEM으로 변경하여 18시간 동안 세포를 배양하고 식방풍 추출물을 각각 시간별로 처리하였고 세포를 수거하였다. 수거된 세포를 수집하여 Lysis buffer (Phosphatase inhibitor+, Protein inhibitor+)를 이용하여 단백질을 추출하되, 세포를 Sonication으로 용해하고, 13,000rpm, 20min, 4 ℃ 원심분리 한 후 상층액을 2㎍/㎕의 농도가 되게 정량 후 웨스턴 블롯하였고, Akt, mTOR, S6K, AMPK, ERK의 인산화 반응을 확인하였다. 그 결과, 도 3에서와 같이 식방풍 추출물 처리로 인해 이들 단백질의 인산화가 확인되어 본 발명의 추출물이 분화된 각 세포에서 성장에 관련된 신호전달 단백질의 인산화를 유도하는 것임이 입증된다. <실시예 5. 손상된 세포에서의 식방풍 추출물의 회복효능 확인 - Myostatin 프로모터 활성 억제 효과> 실시예 5-1. 노화 세포 모델에서의 회복 상태 확인 본 발명의 추출물이 노화 또는 염증으로 인해 세포 손상이 유도된 상태에서 세포 상태를 회복하기 위한 일원으로서, 마이오스타틴 프로모터의 활성을 얼마나 억제하는지 확인하기로 하였다. D-갈락토오스가 C2C12 세포에 처리되면 산화스트레스를 일으키면서 미토콘드리아의 기능이 저하되고, 이로 인해 세포 노화 관련 인자들이 활성화되는 것으로 알려져 있다. 이에 D-갈락토오스가 처리된 노화가 유도된 세포를 이용하여 식방풍 추출물의 마이오스타틴 프로모터의 활성을 확인하였다. 이를 위해 Stable myostatin C2C12 세포 (pGL4.15 공벡터에 마이오스타틴 루시퍼레이즈 프로모터가 들어있는 pMSTN_Luc 벡터로 형질전환됨)를 48 Well-plate에 1X105 cells으로 분주하고, D-갈락토오스(D-GAL : 30 ㎎/㎖)를 식방풍 추출물과 함께 6시간 동안 처리하였다. 이 후, 세포를 Lysis buffer로 용해하고, L