KR-102959373-B1 - 인간화 면역글로불린 유전자좌를 갖는 유전적으로 변형된 비-인간 동물

Abstract

인간화 중쇄 면역글로불린 유전자좌 및/또는 인간화 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 갖는 유전적으로 변형된 동물 및 세포가 제공된다.

Inventors

• 쉔, 유에레이
• 야오, 지아웨이
• 자오, 후이젠
• 장, 야보
• 리우, 릴리
• 루, 후이
• 후앙, 슈웬

Assignees

• 바이오사이토젠 파마슈티컬스 (베이징) 컴퍼니 리미티드

Dates

Publication Date

20260506

Application Date

20200218

Priority Date

20190218

Claims (20)

1. 유전적으로-변형된 비-인간 동물의 제조 방법으로서, 상기 방법은 하기를 포함하는 제조 방법: (a) 제1 인간 염색체를 변형시키는 단계; 여기서 변형된 상기 제1 인간 염색체는 중쇄 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 양측에 도입된 2개의 외인성 재조합 부위를 포함하고; (b) 변형된 제1 인간 염색체를 동물의 세포에 도입하는 단계; 및 (c) 변형된 제1 인간 염색체와 내인성 염색체 사이의 재조합을 유도하는 단계로서, 내인성 염색체는 중쇄 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 양측에 도입된 2개의 외인성 재조합 부위를 포함하여, 하나 이상의 내인성 유전자를 인간 염색체 14의 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 모든 인간 IGHV 유전자, 모든 인간 IGHD 유전자, 및 모든 인간 IGHJ 유전자를 포함하는 연속 인간 서열로 한 단계의 교체에 의해 대체한다.
2. 제 1항에 있어서, 상기 방법은 하기를 더 포함하는 방법 : (d) 제2의 인간 염색체를 변형시키는 단계; 여기서 변형된 제2 인간 염색체는 경쇄 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 양측에 도입된 2개의 외인성 재조합 부위를 포함하고; (e) 변형된 제2 인간 염색체를 동물의 세포에 도입하는 단계; 및 (f) 변형된 제2 인간 염색체와 내인성 염색체 사이의 재조합을 유도하는 단계로서, 내인성 염색체는 경쇄 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 양측에 도입된 2개의 외인성 재조합 부위를 포함하여, 하나 이상의 내인성 유전자를 인간 염색체 2의 내인성 카파 쇄 면역글로불린 유전자좌에서 모든 인간 IGKV 유전자, 및 모든의 인간 IGKJ 유전자를 포함하는 연속 인간 서열로 한 단계의 교체에 의해 대체한다.
3. 제 1항에 있어서, 상기 동물은 마우스인, 방법.
4. 유전적으로-변형된 비-인간 동물의 제조 방법으로서, 상기 방법은 하기를 포함하는 제조 방법: (a) 제1 인간 염색체를 변형시키는 단계; 여기서 변형된 상기 제1 인간 염색체는 경쇄 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 양측에 도입된 2개의 외인성 재조합 부위를 포함하고; (b) 변형된 제1 인간 염색체를 동물의 세포에 도입하는 단계; 및 (c) 변형된 제1 인간 염색체와 내인성 염색체 사이의 재조합을 유도하는 단계로서, 내인성 염색체는 경쇄 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 양측에 도입된 2개의 외인성 재조합 부위를 포함하여, 하나 이상의 내인성 유전자를 인간 염색체 2의 내인성 카파 쇄 면역글로불린 유전자좌에서 모든 인간 IGKV 유전자, 및 모든 인간 IGKJ 유전자를 포함하는 연속 인간 서열로 한 단계의 교체에 의해 대체한다.
5. 제 4항에 있어서, 상기 방법은 하기를 더 포함하는 방법 : (d) 제2의 인간 염색체를 변형시키는 단계; 여기서 변형된 제2 인간 염색체는 중쇄 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 양측에 도입된 2개의 외인성 재조합 부위를 포함하고; (e) 변형된 제2 인간 염색체를 동물의 세포에 도입하는 단계; 및 (f) 변형된 제2 인간 염색체와 내인성 염색체 사이의 재조합을 유도하는 단계로서, 내인성 염색체는 중쇄 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 양측에 도입된 2개의 외인성 재조합 부위를 포함하여, 하나 이상의 내인성 유전자를 인간 염색체 14의 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 모든 인간 IGHV 유전자, 모든 인간 IGHD 유전자, 및 모든 인간 IGHJ 유전자를 포함하는 연속 인간 서열로 한 단계의 교체에 의해 대체한다.
6. 제 4항에 있어서, 상기 동물은 마우스인, 방법.
7. 게놈이 인간 염색체 14의 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 한번의 교체에 의해 하나 이상의 내인성 IGHV, 내인성 IGHD, 및 내인성 IGHJ 유전자의 모든 인간 IGHV, 인간 IGHD, 및 인간 IGHJ 유전자를 포함하는 연속 인간 서열로의 대체를 포함하는 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 유전적으로-변형된 비-인간 동물로서, 인간 IGHV, 인간 IGHD, 및 인간 IGHJ 유전자는 내인성 IGHM, IGHδ, IGHG, IGHE, 및 IGHA 유전자 중 하나 이상에 작동 가능하게 연결되는, 동물.
8. 제7항에 있어서, 동물은 마우스이고, 마우스 IGHV1-85 유전자에서 마우스 IGHJ4 유전자까지의 연속 서열이 한번의 교체에 의해 대체되는, 동물.
9. 게놈이 인간 염색체 2의 내인성 카파 쇄 면역글로불린 유전자좌에서 한번의 교체에 의해 하나 이상의 내인성 IGKV 및 내인성 IGKJ 유전자의 모든 인간 IGKV 및 인간 IGKJ 유전자를 포함하는 연속 인간 서열로의 대체를 포함하는 내인성 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 유전적으로-변형된 비-인간 동물로서, 인간 IGKV 및 인간 IGKJ 유전자는 내인성 IGKC 유전자에 작동 가능하게 연결되는, 동물.
10. 제9항에 있어서, 동물은 마우스이고, 마우스 IGKV2-137 에서 마우스 IGKJ5 까지의 연속 서열이 한번의 교체에 의해 대체되는, 동물.
11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항의 동물로부터 얻어지는, 세포.
12. 세포의 게놈을 변형시키는 방법으로서, (a)인간 염색체를 변형시키는 단계로, 변형된 인간 염색체는 중쇄 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 양측에 도입된 2개의 외인성 재조합 부위를 포함하는 단계; (b) 변형된 인간 염색체를 동물의 세포에 도입하는 단계; 및 (c) 변형된 인간 염색체와 내인성 염색체 간의 재조합을 유도하고, 내인성 염색체는 중쇄 면역글로불린 유전자좌의 가변 영역 양측에 도입된 2개의 외인성 재조합 부위를 포함하여, 이에 의해 하나 이상의 내인성 유전자를 인간 염색체 14의 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 하나 이상의 인간 IGHV 유전자, 하나 이상의 인간 IGHD 유전자, 및 하나 이상의 인간 IGHJ 유전자를 포함하는 연속 인간 서열로 한 단계의 교체에 의해 대체되는 단계; 를 포함하는, 방법. 인간 IGHJ 유전자는 재조합에 의해 내인성 염색체에 통합되는, 방법.
13. 제12항에 있어서, 인간 염색체2의 내인성 카파 쇄 면역글로불린 유전자좌에서 모든 인간 IGKV 유전자, 및 모든 인간 IGKJ 유전자를 포함하는 연속 인간 서열은 또한 한 단계의 교체에 의한 재조합에 의해 내인성 염색체에 통합되는, 방법.
14. 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 방법으로서, 항원에 특이적으로 결합하는 하이브리드 항체를 발현하는 세포에서 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 핵산 서열을 얻는 단계로서, 세포는 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항의 동물을 항원에 노출시킴으로써 얻어지는 단계; 인간 중쇄 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 인간 중쇄 면역글로불린 불변 영역을 인코딩하는 핵산과, 그리고 인간 경쇄 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 핵산을 인간 경쇄 면역글로불린 불변 영역을 인코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결하는 단계; 및 세포에서 핵산을 발현하고, 이에 의해 항체를 얻는 단계; 를 포함하는, 방법.
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Description

인간화 면역글로불린 유전자좌를 갖는 유전적으로 변형된 비-인간 동물 우선권 주장 본 출원은 2019년 2월 18일에 출원된 PCT/CN2019/075406 및 2019년 9월 18일에 출원된 PCT/CN2019/106320의 우선권을 주장한다. 상기 출원들의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 기술 분야 본 개시는 인간화 중쇄 면역글로불린 유전자좌 및/또는 인간화 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 갖는 유전적으로 변형된 동물 및 세포에 관한 것이다. 치료용 항체는 소분자 약물의 성장을 급속히 능가하고 있는 가장 빠르게 성장하는 부류의 치료용 화합물 중 하나이다. 이러한 치료용 항체들은 일반적으로 인간 또는 인간화 항체이다. 인간 또는 인간화 항체는 설치류 항체(예를 들어, 마우스 항체)의 인간화에 의해 또는 파지 라이브러리를 이용함으로써 생성될 수 있다. 이러한 방법들에 의해 생성된 항체는 흔히 최적이 아닌 결합 친화도 및 생물물리학적 속성을 가져 제조의 어려움 및 불량한 약동학으로 이어진다. 특히, 인간화 과정은 결합 친화도에 불리하게 영향을 미치고, 항체에 면역원성 에피토프를 도입할 수 있으며, 파지 라이브러리를 이용하여 발견된 항체는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 제한된 다양성 및 비-네이티브 쌍형성을 나타낸다. 성질을 개선하기 위해서는 흔히 반복적이고 시간-소모적인 실험이 필요하다. 그리고, 일부 경우에, 이러한 항체들은 또한 환자에서 면역원성이기 때문에 시간 경과에 따라 이들의 효능이 약화될 수 있다. 완전 인간 항체를 생성하기 위한 한 가지 가능한 접근법은 인간 항체 레퍼토리를 발현하도록 조작된 트랜스제닉 동물을 사용하는 것이다. 여러 면역글로불린 유전자좌를 갖는 마우스와 같은 트랜스제닉 동물의 세대는 다양한 연구 및 개발 응용에서, 예를 들어, 다양한 생물학적 시스템으로의 약물 발견 및 기초 연구에서 그러한 트랜스제닉 동물의 사용을 가능하게 하였다. 다수의 초기 세대 트랜스제닉 동물은 불완전한 인간 항체 레퍼토리를 갖고, 덜 효율적인 V(D)J 재조합로 인해 항체 생산이 정상 속도보다 낮고, 면역원성 에피토프를 도입할 수 있는 내인성 항체 레퍼토리를 갖고, 다양한 다른 문제들을 갖는다. 인간 항체를 생산하는 효율적이고 비용-효과적인 방법에 대한 필요성, 및 항원에 반응하여 인간화 항체를 생성하는 능력을 갖는 인간화 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물에 대한 필요성이 존재한다. 본 개시는 인간화 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자좌를 갖는 유전적으로 변형된 동물 및 세포에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 개시는 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌, 하나 이상의 인간 IGHV 유전자, 하나 이상의 인간 IGHD 유전자, 및 하나 이상의 인간 IGHJ 유전자를 포함하는 유전적으로-변형된 비-인간 동물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 인간 IGHV 유전자, 인간 IGHD 유전자, 및 인간 IGHJ 유전자는 작동 가능하게 연결되고, VDJ 재배열을 겪을 수 있다. 일부 구현예에서, 동물은 표 1로부터 선택된 약 또는 적어도 150개, 151개, 152개, 153개, 154개, 155개, 156개, 157개, 158개, 159개, 160개 또는 161개의 인간 IGHV 유전자, 표 2로부터 선택된 약 또는 적어도 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 또는 27개의 인간 IGHD 유전자, 및 표 3으로부터 선택된 약 또는 적어도 5개, 6개, 7개, 8개, 또는 9개의 인간 IGHJ 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 IGHV2-10, IGHV3-9, 및 IGHV1-8을 제외한 표 1에서의 모든 인간 IGHV 유전자, 표 2에서의 모든 인간 IGHD 유전자, 및 표 3에서의 모든 인간 IGHJ 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 IGHV5-10-1 및 IGHV3-64D를 제외한 표 1에서의 모든 인간 IGHV 유전자, 표 2에서의 모든 인간 IGHD 유전자, 및 표 3에서의 모든 인간 IGHJ 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 인간 대상체의 인간 14번 염색체의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 모든 인간 IGHV 유전자, 모든 인간 IGHD 유전자, 및 모든 인간 IGHJ 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 인간 세포(예를 들어, 체세포, 배양 세포, 비-면역 세포, 임의의 V(D)J 재배열이 없는 세포)의 인간 14번 염색체의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 모든 인간 IGHV 유전자, 모든 인간 IGHD 유전자, 및 모든 인간 IGHJ 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 동물의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 마우스이고, 동물의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴는 표 4에서의 하나 이상의 마우스 IGHV 유전자, 표 5에서의 하나 이상의 마우스 IGHD 유전자, 및/또는 표 6에서의 하나 이상의 마우스 IGHJ 유전자의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 마우스이고, 동물의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴는 마우스 IGHV1-85 유전자에서 시작하여 마우스 IGHJ4 유전자까지 연속 서열의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 하나 이상의 내인성 IGHM, IGHδ, IGHG3, IGHG1, IGHG2b, IGHG2a, IGHE, 및 IGHA 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된 비변형 인간 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비변형 인간 서열은 약 또는 적어도 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb, 500 kb, 600 kb, 700 kb, 800 kb, 900 kb, 또는 1000 kb이다. 일부 구현예에서, 동물은 인간 IGHV(III)-82에서 시작하여 인간 IGHV1-2까지 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된 비변형 인간 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 인간 IGHV(III)-82에서 시작하여 인간 IGHV6-1까지 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된 비변형 인간 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 인간 IGHD1-1에서 시작하여 인간 IGHJ6까지 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된 비변형 인간 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 인간 IGHV(III)-82에서 시작하여 인간 IGHJ6까지 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된 비변형 인간 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 중쇄 면역글로불린 유전자좌에 대하여 동형접합성이다. 일부 구현예에서, 동물은 중쇄 면역글로불린 유전자좌에 대하여 이형접합성이다. 일부 구현예에서, 동물은 추가로 내인성 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 하나 이상의 인간 IGKV 유전자, 및 하나 이상의 인간 IGKJ 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 동물의 내인성 람다 경쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 설치류(예를 들어, 마우스)이다. 일부 양태에서, 본 개시는 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 하나 이상의 인간 IGHV 유전자를 포함하는 제1 서열; 내인성 서열을 포함하는 제2 서열; 및 하나 이상의 인간 IGHD 유전자, 및 하나 이상의 인간 IGHJ 유전자를 포함하는 제3 서열을 포함하고, 제1 서열, 제2 서열, 및 제3 서열이 작동 가능하게 연결된, 유전적으로-변형된 동물에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 제1 서열은 표 1로부터 선택된 약 또는 적어도 150개, 151개, 152개, 153개, 154개, 155개, 156개, 157개, 158개, 159개, 160개 또는 161개의 인간 IGHV 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 서열은 표 2로부터 선택된 약 또는 적어도 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 또는 27개의 인간 IGHD 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 서열은 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된 비변형 서열이다. 일부 구현예에서, 제3 서열은 약 또는 적어도 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb, 100 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb, 500 kb, 600 kb, 700 kb, 800 kb, 900 kb, 또는 1000 kb이다. 일부 구현예에서, 제2 서열은 약 또는 적어도 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 16 kb, 17 kb, 18 kb, 19 kb, 또는 20 kb인 내인성 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 서열은 표 2로부터 선택된 약 또는 적어도 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 또는 27개의 인간 IGHD 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 서열은 표 3으로부터 선택된 약 또는 적어도 5개, 6개, 7개, 8개, 또는 9개의 인간 IGHJ 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 서열은 표 2에서의 모든 인간 IGHD 유전자, 및 표 3에서의 모든 인간 IGHJ 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 서열은 인간 중쇄 면역글로불린 유전자좌로부터 유래된 비변형 서열이다. 일부 구현예에서, 제3 서열은 약 또는 적어도 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, 70 kb, 80 kb, 90 kb 또는 100 kb이다. 일부 구현예에서, 동물은 동물의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴를 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 마우스이고, 동물의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴는 표 4에서의 하나 이상의 마우스 IGHV 유전자, 표 5에서의 하나 이상의 마우스 IGHD 유전자, 및 표 6에서의 하나 이상의 마우스 IGHJ 유전자의 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 동물은 마우스이고, 동물의 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 파괴는 마우스 IGHV1-85 유전자에서 시작하여 마