KR-102959455-B1 - Analytical method for diagnosing preeclampsia using methylation level of the CpG site cg24440941

Abstract

본 발명은 임신중독증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상자의 시료 중 특정 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는 분석방법을 제공한다.

Inventors

• 류현미
• 임지혜

Assignees

• 차의과학대학교 산학협력단
• 의료법인 성광의료재단

Dates

Publication Date

20260506

Application Date

20240429

Claims (1)

1. 임신중독증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 체외로 분리된 산모의 태반 시료 중 cg24440941의 CpG 부위의 과메틸화 여부를 메틸화-특이적 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응에 의하여 측정하는 단계를 포함하는 분석방법.

Description

CpG 부위 cg24440941의 메틸화 수준을 이용한 임신중독증 진단을 위한 분석방법{Analytical method for diagnosing preeclampsia using methylation level of the CpG site cg24440941} 본 발명은 CpG 부위의 메틸화 수준을 이용하여 임신중독증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 분석방법에 관한 것이다. 임신중독증(Preeclampsia, PE)은 전 세계적으로 모든 임신의 2∼8%에 영향을 미치는 임신성 고혈압 질환으로 산모 사망률과 이환율의 주요 원인 중 하나이다. 임신중독증은 임신 20주 이후에 산모에게 새롭게 발병하는 고혈압과 단백뇨를 특징으로 하는 다기관 장애(multisystem disorder)이다. 단백뇨가 없는 상태에서, 혈소판감소, 신부전, 간기능 장애, 폐부종을 포함한 산모의 장기 기능장애를 동반한, 새로 발병한 고혈압의 소견은 이를 진단하기에 충분하다. 따라서 임상 표현형은 혈압 상승으로부터 신장 및 간 기능 장애 및 발작을 포함하여 더 심각한 합병증에 이르기까지 증후군의 징후에 따라 다양하다. 따라서 최근에는, 일반적으로 경증, 중등도, 중증으로 알려진 증상의 중증도에 따라 PE를 소분류하는 것이 아니라, 심각한 모체 및 태아의 특징 유무에 따라 분류하도록 권장되고 있다. PE의 원인과 병태생리는 대체로 미스터리로 남아 있다. 그러나 유전적, 면역학적, 내분비적, 환경적 요인이 모두 관련되어 있다(Espinoza J. Abnormal fetal-maternal interactions: an evolutionary value, Obstet Gynecol. 2012;120:370-374). 수많은 연구에서, 영양막 운동성 및 침습, 혈관 신생, 세포 부착 및 면역 반응을 포함하여, PE와 관련된 다양한 메커니즘에서의 유전자 발현의 변화가 보고된 바 있다. 후성학적 사건은 이러한 유전자 발현 변화에 중요한 역할을 한다. 이는 PE의 다양한 증상과 발달에 대한 후성학적 변형의 기여를 나타낸다. 후성학적 변형은 DNA 서열을 변화시키지 않고 유전자 발현을 조절한다. DNA 메틸화는 가장 일반적인 후성학적 기전이며, 이는 CpG 부위에서 주로 발생하며 최적의 태반 및 태아 발달에 중요하다. 몇몇 연구는 PE에 의해 나타나는 태반에서의 전체적인 DNA 메틸화의 변화를 조사하였고, 이러한 연구는 후성유전체의 다양한 DNA 영역이 정상 태반에 비해 PE 태반에서 과메틸화 및/또는 저메틸화됨을 보여준다(Blair JD, et al., Mol Hum Reprod. 2013;19:697-708; Ching T, et al., Mol Hum Reprod. 2014;20:885-904; Wang T, et al. Epigenomics. 2019;11:1003-1019; Gao WL, et al. Hypertens Res. 2011;34:655-661; Kulkarni A, et al., DNA Cell Biol. 2011;30:79-84; Leavey K, et al., Clin Epigenetics. 2018;10:28). 그러나 PE의 중증도(severe features)에 따른 DNA 메틸화에 대한 연구는 거의 없다. 따라서 중증도 특징에 따른 PE 태반에서의 DNA 메틸화 프로파일링 분석(comparative DNA methylation profiling analysis)은 이러한 질병의 병태생리에 대한 이해를 향상시킬 수 있다. 도 1은 PE에서 상이하게 메틸화된 CpG 부위(DMCs)의 계층적 클러스터링을 나타낸다. 850K 어레이의 메틸화 정도 값은 독립적인 t 테스트(P < 0.05) 및 배수-변경 기준(fold-change criterion)(|메틸 정도의 델타 평균|≥0.2)로 평가하였다. 다중 테스트로부터의 위양성 결과(false positive results)를 제어하기 위해 Benjamini 및 Hochberg 위발견 비율 방법(false discovery rate method)을 사용하여 P 값을 보정하였다. DMCs에 대한 메틸화 정도 값은 계층적 클러스터링을 거쳤다. DMCs는 x축에 있고 생물학적 샘플은 y축에 있으며, 강한 메틸화는 황색으로 표시하였고, 메틸화가 약하거나 없는 것은 청색으로 표시하였다. a 대조군 대 PE. b 대조군 대 중증 PE. Con:컨트롤. PE: 임신중독증, PES: 중증 임신중독증(preeclampsia with severe features) 도 2는 유의성 있는 변화를 갖는 DMCs의 중첩을 보여주는 벤 다이어그램이다. NT: 정상 임신부, PT: 임신중독증 임신부, PTS: 중증 임신중독증 임신부 PE는 태반 영양막 침습 실패로 인해 산모와 태아 모두에게 심각한 이환율을 보이는 산과 질환이다. 그러나, 그 병태생리학은 여전히 불분명하다. 본 발명자들은 DNA 메틸화 프로파일링을 수행하여 PE 중증도에 관계없이 PE 태반에서 나타나는 DNA 메틸화의 상이한 패턴을 확인하였다. 정상 13명, PE 5명, 중증 PE 임신부 8명의 태반 조직에서 DNA를 추출하였다. Illumina HumanMethylation 850K BeadChip을 사용하여 게놈 전체의 DNA 메틸화 분석을 수행하였다. Illumina HumanMethylation 850K BeadChip을 통해 확보된 β 값은 메틸화된 프로브와 메틸화되지 않은 프로브 사이의 강도 비율을 사용하여 Illumina 어레이의 보정 및 정량에 의해 얻어진다. 즉, β 값은 어레이 상에서 음성 대조군을 사용하여 배경을 빼고, 메틸화된 신호 강도와 메틸화된 신호 및 메틸화되지 않은 신호의 합에 대한 비율로부터 계산되며, 각 CpG 부위에서의 0 내지 1의 β 값은 0 내지 100%까지 메틸화 백분율과 관련된다. 따라서, 대상자로부터 얻어진 태반 시료 중, 특정 CpG 부위에 대한 어레이 데이터로부터 추출된 β 값이 +0.2 보다 클 경우, 해당 CpG 부위에서 유의성 있게 과메틸화(hypermethylation)된 것으로 판단할 수 있다. 또한, 대상자로부터 얻어진 태반 시료 중, 특정 CpG 부위에 대한 어레이 데이터로부터 추출된 β 값이 -0.2 보다 작을 경우, 해당 CpG 부위에서 유의성 있게 저메틸화(hypomethylation)된 것으로 판단할 수 있다. 정상 태반 조직과 비교하여, PE에서의 243개 DMCs와 중증 PE에서의 155개 DMCs를 포함하여, 398개 DMCs에서 유의한 차이가 명확하였다. 이 중 12개의 과메틸화된 DMCs와 3개의 저메틸화된 DMCs는 두 PE 그룹 모두에서 관찰되었으므로 중증도와 무관한 것으로 밝혀졌다. 본 명세서에서, 용어 "CpG 또는 CpGs"라 함은 시토신 및 구아노신 염기를 함유하는 DNA의 디뉴클레오티드 서열을 의미한다. 이러한 디뉴클레오티드 서열은 인간의 DNA에서 메틸화될 수 있다. 또한, 용어 "DMC(differentially methylated CpG site) 또는 DMCs(differentially methylated CpG sites)"는 상이하게 메틸화된 CpG 부위(들)을 말한다. 본 발명은 임신중독증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상자의 시료 중 cg04502985, cg14543412, cg16070018, cg24440941, cg22339775, cg08317794, cg22324103, cg24836826, cg11144986, cg04823299, cg00979438, cg20772657, cg22499381, cg12342501, 및 cg10288111로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는 분석방법을 제공한다. 상기 CpG 부위의 프로브 ID(Probe ID) 서열은 각각 서열번호 1 내지 15와 같다. 즉, 서열번호 1은 프로브 ID cg04502985의 서열이고, 서열번호 2는 프로브 ID cg14543412의 서열이고, 서열번호 3은 프로브 ID cg16070018의 서열이고, 서열번호 4는 프로브 ID cg24440941의 서열이고, 서열번호 5는 프로브 ID cg22339775의 서열이고, 서열번호 6은 프로브 ID cg08317794의 서열이고, 서열번호 7은 프로브 ID cg22324103의 서열이고, 서열번호 8은 프로브 ID cg24836826의 서열이고, 서열번호 9는 프로브 ID cg11144986의 서열이고, 서열번호 10은 프로브 ID cg04823299의 서열이고, 서열번호 11은 프로브 ID cg00979438의 서열이고, 서열번호 12는 프로브 ID cg20772657의 서열이고, 서열번호 13은 프로브 ID cg22499381의 서열이고, 서열번호 14는 프로브 ID cg12342501의 서열이고, 서열번호 15는 프로브 ID cg10288111의 프로브 ID(Probe ID)의 서열이다. 본 발명의 분석방법에 있어서, 상기 대상자의 시료는 인체로부터 체외로 분리된 시료를 말하며, 예를 들어 체외로 분리된 산모의 태반 시료를 포함한다. 산모의 태반 시료는 산부인과에서 실시되는 생검 등을 통하여 얻을 수 있다. 본 발명의 분석방법은 특정 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 메틸화 수준의 측정은 생명공학 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 메틸화 수준의 측정은 메틸화-특이적 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(methylation-specific quantitative real-time PCR)에 의하여 수행될 수 있다. 메틸화-특이적 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하여 얻어진 데이터로부터, 메틸화 수준의 차이는 ΔCt를 통해 추출할 수 있다. ΔCt 값은 ΔCt = Ct MSRE - Ct input으로 계산되며, ΔCt가 작을수록 값이 메틸화 수준이 높은 것을 나타낸다. 이를 이용하여 정상인과 PE 환자의 상기 메틸화 수준 차이를 ΔCt 값을 통해 확인할 수 있다. 본 발명에 의해 cg04502985, cg14543412, cg16070018, cg24440941, cg22339775, cg08317794, cg22324103, cg24836826,