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KR-102959588-B1 - Manufacturing and use of nanoparticles containing extracellular matrix derived from decellularized tissue

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Abstract

본 발명은 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질을 포함하는 나노입자 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 탈세포 비장 유래 세포외기질로부터 하이드로젤을 제작한 후, 동결분쇄하여 균일한 크기의 나노입자 및 이의 제조방법과 용도 등에 관한 것이다. 본 발명의 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질 나노입자는 면역 증강 효과, 생체 적합성, 안전성, 생분해성, 사용성 등 우수한 장점이 많아 새로운 백신 면역 증진 보조제로서 활용될 수 있다.

Inventors

  • 조승우
  • 이미정
  • 송영석
  • 황용순

Assignees

  • 연세대학교 산학협력단
  • 주식회사 세라트젠

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20240325
Priority Date
20230324

Claims (20)

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  7. (a) 분리된 비장 또는 근육 조직을 파쇄한 후 계면활성제 및 알칼리성 제제를 혼합하는 단계; (b) 상기 비장 또는 근육 조직을 동결건조하여 탈세포 비장 또는 근육 유래 세포외기질(SpEM 또는 MEM)을 제조하는 단계; (c) 상기 탈세포 비장 또는 근육 유래 세포외기질(SpEM 또는 MEM)을 단백질 분해효소 용액에 용해시키는 단계; (d) 상기 용해 용액에 용매를 혼합한 후 하이드로젤 제조하는 단계; 및 (e) 상기 제조된 하이드로젤을 건조한 후 동결 분쇄하여 나노입자를 제조하는 단계;를 포함하고, 상기 하이드로젤 나노입자는 세포외기질이 1 내지 8 mg /mL 농도로 포함되며, 탄성계수가 10 내지 60 Pa이고, 입자 크기는 100 내지 150 nm 인, 탈세포 비장 또는 근육 유래 세포외기질 하이드로젤 나노입자 제조방법으로서, 상기 (c) 단계는 탈세포 비장 또는 근육 유래 세포외기질을 30 내지 40℃의 온도에서 3 내지 5 mg/mL 농도의 펩신 용액에 용해시키는 것이며, 상기 (e) 단계에서 동결 분쇄는 영하 200 내지 180℃에서 15 내지 25분 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 탈세포 비장 또는 근육 유래 세포외기질 하이드로젤 나노입자 제조방법.
  8. 삭제
  9. 제7항에 있어서, 상기 계면활성제는 도데실 황산 나트륨(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS), 트라이톤 X-100(Triton X-100), 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS), 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propanesulfonate (CHAPSO), 디기토닌(digitonin), NP-40, Tween-20, 유레아(urea) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 탈세포 비장 또는 근육 유래 세포외기질 하이드로젤 나노입자 제조방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 알칼리성 제제는 수산화암모늄, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 테트라메틸암모늄 히드록시드, 콜린, 모노에탄올 아민 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 탈세포 비장 또는 근육 유래 세포외기질 하이드로젤 나노입자 제조방법.
  11. 삭제
  12. 제7항에 있어서, 상기 용매는 PBS(phosphate buffered saline), 증류수 및 수산화나트륨으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 탈세포 비장 또는 근육 유래 세포외기질 하이드로젤 나노입자 제조방법.
  13. 제7항에 있어서, 상기 탈세포 비장 또는 근육 유래 세포외기질(SpEM 또는 MEM)은 글리코스아미노글리칸, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, ECM 글리코프로테인 (ECM glycoproteins), 프로테오글리칸 (Proteoglycans), ECM 레귤레이터 (ECM regulators), ECM 관련 단백질 (ECM-affiliated proteins) 및 분비 인자 (Secreted factors)를 포함하는 것을 특징으로 하는 탈세포 비장 또는 근육 유래 세포외기질 하이드로젤 나노입자 제조방법.
  14. 제7항에 있어서, 상기 (a) 단계는 비장 또는 근육에 0.01% (v/v) 내지 1% (v/v)의 Sodium dodecyl sulfate(SDS)을 10 내지 20시간 동안 처리한 후, 0.1% (v/v) 내지 2% (v/v)의 Triton X-100 및 0.01% (v/v) 내지 1% (v/v)의 수산화 암모늄 혼합용액에서 10 내지 20시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 탈세포 비장 또는 근육 유래 세포외기질 하이드로젤 나노입자 제조방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제7항에 있어서, 상기 (e) 단계에서 동결 분쇄 이후에 필터를 사용하여 추가적으로 분리하는 것을 특징으로 하는 탈세포 비장 또는 근육 유래 세포외기질 하이드로젤 나노입자 제조방법.
  19. 제7항에 있어서, 상기 (d) 단계에서 하이드로젤은 손실 탄성률(G'')보다 높은 저장 탄성률(G')를 갖는 것을 특징으로 하는 탈세포 비장 또는 근육 유래 세포외기질 하이드로젤 나노입자 제조방법.
  20. 삭제

Description

탈세포 조직 유래 세포외기질을 포함하는 나노입자 제조 및 이의 용도 {Manufacturing and use of nanoparticles containing extracellular matrix derived from decellularized tissue} 본 발명은 탈세포 조직 유래 세포외기질(Spleen extracellular matrix; SpEM)을 포함하는 나노입자 제조 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 탈세포 비장 유래 세포외기질로부터 하이드로젤을 제작한 후, 동결분쇄하여 균일한 크기의 나노입자 및 이의 제조방법과 용도 등에 관한 것이다. 조직공학(tissue engineering)은 생명과학, 의학, 공학 등의 기존 과학 영역의 기본 개념과 기술을 바탕으로 생체 조직의 대용품을 만들어 이식함으로써 생체 기능을 유지, 향상, 복원하여 손상된 조직이나 장기를 정상적인 조직으로 대체, 재생시키기 위한 새로운 학문이다. 최근 조직공학 분야에서는 탈세포화 기술을 이용하여, 조직유래 탈세포화 세포 외 기질(Decellularized extracellular matrix, dECM)을 2차원 및 3차원 구조의 ECM 기반 지지체뿐만 아니라, 3D 프린팅을 위한 바이오 잉크 소재 등 다양한 분야로 적용하고 있다. 종래에 보고된 탈세포 조직 유래 세포외기질 나노입자는 동결건조된 탈세포 조직 유래 세포외기질을 분쇄하여 제작된 고체 상태의 나노입자이다. 기존에 보고된 탈세포 조직 유래 나노입자 제조 방식의 경우 동결건조된 탈세포 조직 자체를 동결분쇄를 하는데 동결분쇄기만으로는 나노 크기로 입자를 제조하기 어렵고 마이크로 크기 수준의 입자 제조만 가능하다. 따라서 종래 방식으로는 동결분쇄기로 마이크로입자를 제작한 후 고압균질기를 사용하거나 또는 에탄올 상에서 에멀젼 형태로 분쇄하는 추가 단계를 통해 나노입자를 제작해야하는 번거로움이 있다. 이러한 추가적인 물리적 분쇄 단계를 거치거나 에탄올과 같은 유기용매를 사용하게 되면 탈세포 조직 내 단백질 변성 및 손상을 유발할 수 있다. 한편, 비장(Spleen)은 세망내피계 및 조혈조직에 속하는 장기 중 하나로, 크기 약 10x8x4cm, 무게 약 110g으로 어두운 적자색을 띠고, 좌측상복부의 횡격막 아래에 위치하며, 위, 대장과 접하고 있다. 혈중의 이물여과와 항체생산에 관여하는 것 외에, 오래된 적혈구, 백혈구, 혈소판을 파괴하여 조혈이나 혈액의 저장장소로서 작용한다. 또한 비장은 면역세포의 생성, 발달 및 성숙 기능을 담당하는 조직에 해당한다. 종래에 탈세포 장 조직 유래 세포외기질을 이용한 백신 보조제 연구가 진행된 바가 있으나 비교적 크기가 큰 마이크로 입자(약 50~150 μm)로 제작되어 체내 주입이 용이하지 않으며 주사 접종 시 큰 통증이 동반될 것으로 예측되고 세포 보다 훨씬 크기가 큰 마이크로 입자의 경우 면역세포와의 접촉 및 상호작용에 있어 제한적이므로 백신 보조제로서 실용성이 낮았다. 아울러 사용된 탈세포 장 조직 유래 세포외기질은 면역기능 증진에 필요한 단백질들이 부족하여 면역 증강 효과 및 면역 특이적 미세환경을 제공하는데 한계가 있다. 이러한 배경하에서, 본 발명자들은 비장 조직을 탈세포화 공정을 거쳐 세포 및 핵 성분을 모두 제거한 탈세포 비장 조직을 제조하고 이를 이용하여 제작된 하이드로젤의 동결분쇄를 통하여 비장 조직의 조직 특이적 단백질과 세포외기질을 보존하고 있는 나노입자를 제작하였다. 상기 나노입자를 사용함으로써 비장 조직에 포함된 다양한 면역 반응 관련 단백질들이 면역 미세환경을 제공하고 면역 반응을 활성화하여 향상된 면역 증진 효과를 유도할 수 있음을 확인하였으며, 또한, 탈세포 조직 유래 세포외기질의 우수한 생체적합성과 조직 친화성을 가지므로 안전한 백신 면역 증강 보조제로서의 가능성을 확인하였다. 삭제 도 1은 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질 제조에 관한 것이다. 도 2는 제조된 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질의 DNA, 콜라겐, 글리코스아미노글리칸의 잔존율을 확인한 결과에 관한 것이다. 도 3은 제조된 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질의 성분을 조직학 분석을 통해 핵 제거와 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸 보존을 확인한 결과에 관한 것이다. 도 4은 제조된 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질의 성분을 면역조직화학염색을 통해 Fibronectin 및 Laminin 성분을 확인한 결과에 관한 것이다. 도 5 내지 7은 제조된 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질의 하이드로젤 제작 및 기계적 물성 측정에 관한 것이다. 도 8 내지 11은 제조된 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질의 단백체 분석에 관한 것이다. 도 12는 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질 나노입자 제작 과정에 관한 것이다. 도 13 및 도 14는 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질 나노입자 제작을 위한 동결 분쇄 시간 최적화에 관한 것이다. 도 15 및 도 16은 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질 나노입자 제작을 위한 추가 필터 과정에 관한 것이다. 도 17 및 18은 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질 나노입자 크기 및 형태 분석 결과에 관한 것이다. 도 19는 동적 광산란법을 통해 다양한 배치의 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질 나노입자의 배치간 크기 균일성을 확인한 결과이다. 도 20은 다양한 탈세포 조직 유래 세포외기질 나노입자 제작에 관한 것이다. 도 21은 탈세포 조직 유래 세포외기질 나노입자의 안정성 분석에 관한 것이다. 도 22 및 도 23은 탈세포 조직 유래 세포외기질 나노입자의 주입력 분석에 관한 것이다. 도 24는 수지상세포의 성숙화를 유도하는 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질 나노입자 효능에 관한 것이다. 도 25 내지 27은 수지상세포의 성숙화를 유도하는 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질 나노입자의 최적 농도 선정에 관한 것이다. 도 28 내지 도 29는 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질 나노입자의 세포 독성 및 생체 적합성 평가 결과에 관한 것이다. 도 30 내지 39는 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질(SpEM)과 탈세포 근육 조직 유래 세포외기질(MEM) 단백체 비교 결과에 관한 것이다. 도 40 및 도 41은 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질 나노입자 (SpEM)와 탈세포 근육 조직 유래 세포외기질 (MEM) 나노입자의 수지상세포 성숙도를 비교한 결과이다. 도 42는 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질 (SpEM) 나노입자와 탈세포 근육 조직 유래 세포외기질 (MEM) 나노입자에 의한 세포 내 항원 흡수 효과를 비교한 결과이다. 도 43은 마우스를 사용하여 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질 나노입자의 체내 안정성을 확인한 평가에 관한 것이다. 도 44는 마우스의 무게를 측정하여 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질 나노입자의 체내 생체적합성을 평가한 결과에 관한 것이다. 도 45는 마우스의 비장 무게를 측정하여 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질 나노입자의 체내 염증 유발 유무를 확인한 결과에 관한 것이다. 도 46은 마우스의 체중 대비 비장 무게 비율을 분석하여 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질 나노입자의 면역 반응 유발 유무에 대해서 확인한 결과이다. 도 47은 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질 나노입자의 체내 생체적합성 분석을 위해 조직학 분석을 진행한 결과에 관한 것이다. 도 48은 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질 나노입자의 체내 안정성을 확인하기 위해 주요 장기들의 조직학 분석을 통해 전신독성을 평가한 결과에 관한 것이다. 도 49는 전혈구 검사에서 백혈구 수, 적혈구 수, 헤모글로빈, 적혈구 용적률, 평균 적혈구 용적, 평균 적혈구 혈색소, 평균 적혈구 혈색소 농도 등을 측정하여, 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질 나노입자의 체내 생체적합성 분석 결과에 관한 것이다. 도 50은 혈청 생화학 검사를 통해 혈액요소질소, 크레아티닌, 알라닌아미노전이효소, 혈당, 혈청 총단백 수치를 측정하여 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질 나노입자의 체내 생체적합성 분석 결과에 관한 것이다. 도 51은 마우스에 SpEM 나노입자를 주사하여 SpEM 나노입자의 면역 증강 효과를 평가한 것에 관한 것이다. 도 52는 수지상세포의 성숙화를 유도하는 탈세포 비장 조직 유래 세포외기질 나노입자의 백신 면역 보조제로서 면역 반응 향상 기능을 평가한 결과에 관한 것이다. 이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다. 달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고 저서에 기술되어 있다. 본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다. 본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용 가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 본 발명은 탈세포 생체 조직 유래 세포외기질(Spleen extracellular matrix; SpEM) 나노입자를 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 나노입자는 분리된 생체 조직으로부터 얻은 탈세포 생체 조직 유래 세포외기질(SpEM)을 하이드로젤화 한 후 동결 분쇄하여 제조된 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 생체 조직은 비장(Spleen), 식도 (Esophagus), 심장 (Heart), 신장 (Kidney),