KR-102959626-B1 - Primer and probe set for loop-mediated isothermal amplification for genotype detection of ABO blood type

Abstract

본 발명은 ABO식 혈액형의 유전자형 검출을 위한 고리-매개 등온증폭(LAMP)용 프라이머 및 프로브 세트; 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 ABO식 혈액형의 유전자형 검출용 조성물 및 키트; 및 상기 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 ABO식 혈액형의 유전자형 검출 방법에 관한 것으로서, 높은 특이성 및 민감도로 신속하게 ABO식 혈액형의 유전자형을 검출할 수 있어, 범죄현장에서 유효증거물의 식별에 활용하는 등 법의학 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

Inventors

• 임시근
• 최호권
• 최지우
• 곽경현
• 김예빈
• 김은별

Assignees

• 성균관대학교산학협력단

Dates

Publication Date

20260506

Application Date

20230314

Claims (14)

1. 하기 그룹의 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 ABO식 혈액형의 유전자형 검출을 위한 고리-매개 등온증폭(LAMP)용 프라이머 및 프로브 세트: (i) 서열번호 1, 2, 3, 5, 6 및 7의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 3 및 18의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 프라이머 및 프로브 세트; (ii) 서열번호 1, 2, 4, 5, 6 및 7의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 4 및 18의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 프라이머 및 프로브 세트; (iii) 서열번호 8, 10, 11, 13, 15 및 16의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 11 및 19의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 프라이머 및 프로브 세트; 및 (iv) 서열번호 9, 10, 12, 14, 15 및 17의 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 12 및 19의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는 프라이머 및 프로브 세트.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 프로브는 형광 표지인자(reporter dye) 또는 소광물질(quencher)이 결합된 것인, 프라이머 및 프로브 세트.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 서열번호 18 및 19의 염기서열을 포함하는 프로브는 형광 표지인자가 결합된 것인, 프라이머 및 프로브 세트.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 서열번호 3, 4, 11 및 12의 염기서열을 포함하는 프로브는 소광물질이 결합된 것인, 프라이머 및 프로브 세트.
5. 제 2 항에 있어서, 상기 형광 표지인자는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), TET(tetrachlorofluorescein), HEX(hexachloro-6-carboxyfluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), NED(N-(1-naphthyl) ethylenediamine), Cy5(cyanine-5) 및 Cy3(cyanine-3)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 프라이머 및 프로브 세트.
6. 제 2 항에 있어서, 상기 소광물질은 TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), DDQ(Deep Dark Quencher), 답실(Dabcyl), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black) 및 NFQ-MGB(nonfluorescent quencher-minor groove binder)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 프라이머 및 프로브 세트.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 ABO식 혈액형의 유전자형 검출용 조성물.
8. 제 7 항에 따른 ABO식 혈액형의 유전자형 검출용 조성물을 포함하는 ABO식 혈액형의 유전자형 검출용 키트.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 키트는 DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가적으로 더 포함하는 것인, 키트.
10. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 시료로부터 분리된 DNA에 대하여 LAMP를 수행하는 단계를 포함하는 ABO식 혈액형의 유전자형 검출 방법.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 방법은 LAMP에 의한 유전자 증폭 여부를 확인하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것인, 방법.
12. 제 11 항에 있어서, 상기 유전자 증폭 여부는 형광 그래프를 통해 실시간으로 확인하는 것인, 방법.
13. 제 11 항에 있어서, 상기 유전자 증폭 여부는 Ct 값을 통해 확인하는 것인, 방법.
14. 제 13 항에 있어서, 상기 Ct 값이 20 이상 55 미만으로 확인되면 프라이머 및 프로브 세트에 의해 유전자 증폭이 일어난 것으로 판단하는 것인, 방법.

Description

ABO식 혈액형의 유전자형 검출을 위한 고리-매개 등온증폭용 프라이머 및 프로브 세트{Primer and probe set for loop-mediated isothermal amplification for genotype detection of ABO blood type} 본 발명은 ABO식 혈액형의 유전자형 검출을 위한 고리-매개 등온증폭(LAMP)용 프라이머 및 프로브 세트; 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 ABO식 혈액형의 유전자형 검출용 조성물 및 키트; 및 상기 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 ABO식 혈액형의 유전자형 검출 방법에 관한 것이다. 범죄현장에서 발견되는 증거물은 형태부터 크기까지 다양하게 발견되고 있다. 그런데, 사건 수사에 도움이 되는 유효한 증거물을 식별하고 무관한 증거물은 배제하는 것이 중요하지만, 현재는 발견되는 증거물을 모두 채취하여 STR 분석을 의뢰하는 상황이어서 시간적으로나 비용적인 측면에서 낭비가 심한 상황이다. 기존 ABO식 혈액형을 구별하는 방법은 항원-항체 원리를 이용한 방법이 있다. 이는 항-A 시약과 항-B 시약을 각각 혈액에 떨어트려 응집반응을 통해 표현형을 식별하는 혈청학적인 방법이다. 그러나, 이러한 방법은 혈액에만 적용이 가능하고, 다른 체액에는 적용할 수 없으며, 오래되고 부패한 시료에도 적용할 수 없다는 한계가 있다. 또한, 유전학적인 분석을 통해 ABO식 혈액형을 구분하는 방법이 있으며, 이는 체액의 종류와 관계없이 DNA가 존재하는 생체증거물에서 분석이 가능하다. 그러나, 이러한 방법은 분석 시간이 오래 걸리고 복잡한 기기가 요구되어, 현장에서 빠른 시간에 적용하기 어렵다는 문제점이 있다. 고리-매개 등온증폭법(Loop-Mediated Isothermal Amplification, 이하 "LAMP")은 표적 유전자에서 6개 또는 8개의 영역을 선택하여 조합한 4개 또는 6개의 프라이머를 사용하여 사슬치환반응을 이용해 증폭시키는 유전자 증폭법이다. 중합효소 연쇄 반응(PCR)법과 비교하여, 한 가닥에서 두 가닥으로 변성반응이 필요없어, 60~65℃의 온도에서 반응이 진행하는 특징이 있고, 서멀사이클러와 같은 기기가 필요하지 않다. 또한, 증폭속도가 빠르고, 특이성도 높아 (표적이외의 것에는 증폭이 어려움), 반응액의 백탁(뽀얗게 흐림)을 보는 것으로도 템플릿(표적)이 증가했는지를 확인할 수 있다. 이에 본 발명자들은 현장에서 ABO식 혈액형의 유전자형을 신속하고 정확하게 검출하기 위해 LAMP용 프라이머 및 프로브 세트를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다. 도 1a는 ABO식 혈액형의 유전자형 식별을 위한 3가지 SNP 위치(위쪽 패널) 및 LAMP에 의한 유전자 증폭과정과 LAMP용 프로브의 표적 위치(아래쪽 패널)를 나타낸 모식도이고, 1b는 LAMP 수행에 따른 각 혈액형별 유전자 증폭 결과이다. 도 2는 각 혈액형별 대립유전자의 2가지 SNP에서 나타나는 염기서열 모식도이다 (G: 구아닌, C: 사이토신, 및 D: 결실). 도 3은 6가지 유전자형(왼쪽 위부터 오른쪽으로 순서대로 AA, AO, BB, BO, AB, OO)에 대하여 261-deletion 세트와 803-C 세트를 동시에 이용하여 LAMP를 수행한 후 형광 그래프 결과를 나타낸 것이다. 도 4는 6가지 유전자형(왼쪽 위부터 오른쪽으로 순서대로 AA, AO, BB, BO, AB, OO)에 대하여 261-G 세트 및 803-G 세트를 동시에 이용하여 LAMP를 수행한 후 형광 그래프 결과를 나타낸 것이다. 도 5는 다양한 DNA 용량(10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg 및 1 pg)의 AA형 유전자형 시료에 대하여 261-G 세트(왼쪽) 및 803-G 세트(오른쪽)를 이용하여 LAMP를 수행한 후 형광 그래프 결과를 나타낸 것이다. 도 6은 다양한 DNA 용량(10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg 및 1 pg)의 AO형 유전자형 시료에 대하여 261-deletion 세트(위쪽), 261-G 세트(중간) 및 803-G 세트(아래쪽)를 이용하여 LAMP를 수행한 후 형광 그래프 결과를 나타낸 것이다. 도 7은 다양한 DNA 용량(10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg 및 1 pg)의 BB형 유전자형 시료에 대하여 261-G 세트(왼쪽) 및 803-C 세트(오른쪽)를 이용하여 LAMP를 수행한 후 형광 그래프 결과를 나타낸 것이다. 도 8은 다양한 DNA 용량(10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg 및 1 pg)의 BO형 유전자형 시료에 대하여 261-deletion 세트(왼쪽위), 261-G 세트(오른쪽위), 803-C 세트(왼쪽아래) 및 803-G 세트(오른쪽아래)를 이용하여 LAMP를 수행한 후 형광 그래프 결과를 나타낸 것이다. 도 9는 다양한 DNA 용량(10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg 및 1 pg)의 AB형 유전자형 시료에 대하여 261-G 세트(위쪽), 803-C 세트(중간) 및 803-G 세트(아래쪽)를 이용하여 LAMP를 수행한 후 형광 그래프 결과를 나타낸 것이다. 도 10은 다양한 DNA 용량(10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg 및 1 pg)의 OO형 유전자형 시료에 대하여 261-deletion 세트(왼쪽) 및 803-G 세트(오른쪽)를 이용하여 LAMP를 수행한 후 형광 그래프 결과를 나타낸 것이다. 이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명에 사용되는 용어는 본 발명의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 기술분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 임의로 선정된 용어도 있으며, 이 경우 해당 실시예의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서, 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다. 본 발명에서 어느 구성요소 또는 어느 단계를 "포함한다"고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소 또는 다른 단계를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소 또는 다른 단계를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명은 하기 그룹에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 ABO식 혈액형의 유전자형 검출을 위한 고리-매개 등온증폭(LAMP)용 프라이머 및 프로브 세트: (i) 서열번호 1, 2, 3, 5, 6 및 7의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 3 및 18의 염기서열을 포함하는 프로브를 포함하는 프라이머 및 프로브 세트; (ii) 서열번호 1, 2, 4, 5, 6 및 7의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 4 및 18의 염기서열을 포함하는 프로브를 포함하는 프라이머 및 프로브 세트; (iii) 서열번호 8, 10, 11, 13, 15 및 16의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 11 및 19의 염기서열을 포함하는 프로브를 포함하는 프라이머 및 프로브 세트; 및 (iv) 서열번호 9, 10, 12, 14, 15 및 17의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 12 및 19의 염기서열을 포함하는 프로브를 포함하는 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다. 본 발명의 용어, "고리-매개 등온증폭법(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP)은 표적 유전자에서 6개 또는 8개의 영역을 선택하여 조합한 4개 또는 6개의 프라이머를 사용하여 사슬치환반응을 이용해 증폭시키는 유전자 증폭법으로서, Bst, Gsp 등의 중합효소를 이용하여 등온의 조건에서 반응을 수행하는 방법이다. 본 발명의 용어, "다중 실시간 고리-매개 등온증폭법(multiplex real-time LAMP)은 증폭 유무를 실시간으로 확인하는 방법으로서, 다수의 유전자를 동시에 실시간으로 검출할 수 있는 방법이다. 본 발명에 있어서, 상기 프라이머 및 프로브 세트는 단일-단계(one-step) LAMP에 사용되는 것일 수 있고, 또는 다중 실시간 LAMP에 사용되는 것일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서는 (i) 프라이머 및 프로브 세트와 (iii) 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 다중 실시간 LAMP를 통해 표적 DNA를 동시에 증폭하여 결과를 분석하고, (ii) 프라이머 및 프로브 세트와 (iv) 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 다중 실시간 LAMP를 통해 표적 DNA를 동시에 증폭하여 결과를 분석하는 것일 수 있다. 본 발명의 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3'-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로서, 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고, 템플레이트 가닥 복사을 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 염기서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지 dNTP(Deoxynucleoside triphosphate)의 존재 하에 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머 세트는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 염기서열은 또한 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 세트의 염기서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 본 발명의 용어, "내부 프라이머(inner primer)"는 템플레이트 DNA에 결합하여 새로운 DNA 사슬 합성의 시작점으로 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 용어, "외부 프라이머(outer primer)"는 내부 프라이머가 템플레이트 DNA에 결합한 위치보다