KR-102960036-B1 - Composition for Facilitating the Differentiation of Stem Cell Spheroids Comprising the Extract of Centipeda minima as an Effective Ingredient

Abstract

본 발명은 줄기세포 스페로이드의 골분화를 촉진시키기 위한 조성물 및 이를 이용한 골분화 촉진 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 중대가리풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진용 조성물은 줄기세포 스페로이드의 형태를 유지하면서 줄기세포 스페로이드의 골분화를 촉진시키는 효과가 있으므로, 줄기세포 스페로이드의 골분화를 촉진시키고자 할 때 본 발명의 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진용 조성물이 유용하게 이용될 수 있다.

Inventors

• 박준범
• 이현진
• 최상호
• 무하메드 살라하 우딘
• 이상우

Assignees

• 가톨릭대학교 산학협력단
• 한국생명공학연구원

Dates

Publication Date

20260506

Application Date

20220328

Claims (15)

1. 중대가리풀 추출물을 유효성분으로 0.01 내지 0.1 μg/ml 포함하는 치은(gingiva) 유래 줄기세포 스페로이드(spheroid)의 골분화 촉진용 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 골분화는 상기 치은(gingiva) 유래 줄기세포가 조골세포로 분화하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진용 조성물.
5. 삭제
6. 중대가리풀 추출물을 유효성분으로 0.01 내지 0.1 μg/ml 포함하는 치은(gingiva) 유래 줄기세포 배양용 배지.
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 분리된 치은(gingiva) 유래 줄기세포의 스페로이드에 중대가리풀 추출물을 처리하는 단계를 포함하며, 상기 중대가리풀 추출물은 0.01 내지 0.1 μg/ml 포함되는 것을 특징으로 하는 치은(gingiva) 유래 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진 방법.
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 제10항에 있어서, 상기 치은(gingiva) 유래 줄기세포 스페로이드는 오목한 표면에서 배양하는 것을 특징으로 하는 치은(gingiva) 유래 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진 방법.
15. 제10항 및 제14항 중 어느 한 항에 의해 분화된 조골세포를 유효성분으로 포함하는 골결손증 예방 또는 치료용 조성물.

Description

중대가리풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 스페로이드의 분화 촉진용 조성물{Composition for Facilitating the Differentiation of Stem Cell Spheroids Comprising the Extract of Centipeda minima as an Effective Ingredient} 본 발명은 중대가리풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 스페로이드의 골분화 촉진용 조성물 및 이를 이용한 골분화 촉진 방법에 관한 것이다. 중대가리풀(Centipeda minima L.)은 중국에서 Ebushicao(EBSC)로 알려져 있다. 중국 전통 의학에서 따르면 중대가리풀(Centipeda minima)이 바람을 몰아내고, 구멍을 청소하고, 해독 및 붓기를 위해 오랫동안 사용되어 왔다(Liu M., et al., 2021, J AOAC Int). 중대가리풀(Centipeda minima)은 비염 치료, 통증 완화 및 부종 감소에 사용되어 왔으며 최근에는 유방암, 결장암 및 비인두암에 대해 서로 다른 반응률로써 압도적인 항종양 효과를 나타내는 것으로 알려져 있는 한약재이다(Yao J., et al., 2022, J Ethnopharmacol 282: 114583). 중국 전통 약초인 중대가리풀(Centipeda minima)는 항염 및 항산화 특성을 가지고 있다(Fan XZ., et al., 2021, Phytomedicine 91: 153689). 중대가리풀(Centipeda minima)의 휘발성 오일은 알레르기 비염 치료의 다중 표적 및 다중 경로이며, 이는 알레르기 비염 치료에 대한 새로운 연구 기반 및 참고 자료를 제공한다(Jia Y., et al., 2021, Pharm Biol 59: 606-618). 최근 몇 년 동안 줄기세포 연구는 큰 관심을 불러 일으켰고 많은 연구가 이루어지고 있다. 줄기세포는 다양한 조직으로 분화할 수 있을 뿐만 아니라 다양한 인자를 분비하며, 파라크라인 효과(paracrine effect)라고 불리우는 이 기능이 주변 조직에 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다(Lee, H., et al., 2018. Adv Clin Exp Med 27: 971-977). 최근에는 줄기세포가 조직재생에 적용되고 있다(Kang, S.H., et al., 2019. J Periodontal Implant Sci 49: 258-267). 특히, 3차원 스페로이드를 적용하여 세포 생존, 줄기세포능, 혈관신생 특성 및 항염증 효과의 개선을 통해 치료 잠재력을 전반적으로 향상시킬 수 있다(Petrenko, Y., et al., 2017, Stem Cell Res Ther 8: 94). 골절이나 종양제거 후 형성된 국소적인 골 조직 결손부의 치료나 골 관절염에 대한 인공 관절 삽입 치료 시, 골 조직 이식에 대한 수요는 매우 크다. 그러나, 골 조직 이식은 임상적 이용에 있어 한계점과 단점을 가지고 있어서, 골 조직 대체물에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 줄기세포를 이용하여 골 손실의 치료를 위한 재생의학 관점의 연구도 활발히 진행되고 있다. 이와 관련하여 골 결손과 관련된 질환의 세포 치료제로서 조골세포(osteoblast)의 분화촉진과 활성화등이 연구되고 있다. 특히, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)로부터 특정 단백질 또는 유전자를 이용하여 조골세포로 분화시키는 기술들이 보고되고 있다. 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 중간엽 계통으로 분화할 수 있는 다능성 세포이며 다양한 조직에서 분리할 수 있으며 인 비트로(in vitro)에서 쉽게 배양할 수 있다(Castro-Manrreza, M.E., 2015, Journal of immunology research 394917-394917). 종래의 연구에 따르면, 치은(gingiva) 유래 중간엽 줄기세포는 임상적으로 뼈 재건과 같은 골재생에 있어서, 줄기세포 기반 치료에 새로운 공급원이 될 수 있다. 또한, 인간 치은(gingiva) 유래 중간엽 줄기세포는 재생 의학에서 세포 치료를 위한 골수(bone marrow) 유래 중간엽 줄기세포보다 우수함이 밝혀졌다(Tomar GB, Srivastava RK, Gupta N, Barhanpurkar AP, Pote ST, Jhaveri HM, et al. Human gingiva-derived mesenchymal stem cells are superior to bone marrow-derived mesenchymal stem cells for cell therapy in regenerative medicine. Biochem Biophys Res Commun 2010;393:377-383.). 줄기세포의 다른 공급원과 마찬가지로 치은 유래 중간엽 줄기세포에서 면역 조절 성질이 발견되었다. 치은 조직으로부터 유래된 줄기세포는 격리의 용이성, 접근 가능한 조직 공급원 및 빠른 생체 외 팽창을 포함한 몇 가지 장점을 가지고 있다. 지금까지 마이크로 웰을 이용한 3차원 배양을 통한, 치은 유래 줄기세포(gingiva-derived stem cells)로 구성되는 세포 스페로이드에 대한 중대가리풀의 효과에 대해서 보고되지 않았다. 도 1은 본 발명에 따른 줄기세포 스페로이드 배양 및 분석방법에 대한 개략도이다. 도 2는 배양 1, 3, 5 및 7 일자의 줄기세포 스페로이드의 형태를 보여주는 사진이며, 스케일바는 200μm을 나타낸다(원래 배율 x 200). 도 3은 줄기세포 스페로이드에 중대가리풀 추출물을 최종농도 0.001, 0.01, 0.1, 및 1 μg/ml로 처리한 후, 배양 1, 3, 5 및 7 일자에 세포 스페로이드의 직경(diameter)을 분석한 결과이다. 도 4는 배양 1, 3, 5 및 7 일자의 CCK-8(Cell Counting Kit-8) 분석에 의한 세포 생존도를 나타내는 그래프이다. 도 5는 배양 7 일자의 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase)의 활성을 나타내는 그래프이다. 도 6은 배양 14 일자의 알리자린 레드 S 염색 결과를 나타내는 그래프이다. 도 7은 배양 14 일자의 알리자린 레드 S 염색의 정량분석 결과를 나타내는 그래프이다. 본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다. 실시예 실험 재료 및 방법 1. 중대가리풀(Centipeda minima) 추출물의 제조 본 발명의 중대가리풀(Centipeda minima L.)은 방글라데시의 Chittagong 지역, Noakhali 지구에 있는 Sonaimuri 하위 지구에서 살라 후딘 박사(Md. Salah Uddin)에 의해 수집되었다. KRIB 0054834로 기록된 바우처 표본이 한국생명공학연구원 식물표본관에 기탁되었다. 중대가리풀의 종자를 건조하고 분쇄한 후 생성된 분말(70 g)을 45에서 3일 동안, 99.9% (v/v) 메탄올 1 L로 반복적인 초음파 처리(15 분) 및 침지(2 시간)하여 추출하였다. 상기 생성물을 비 형광면(non-fluorescence cottons)으로 여과하고 회전식 증류기(N-1000SWD, EYELA)를 이용하여 45에서 감압 하에서 농축하고 동결 건조에 의해 5.23g의 중대가리풀 추출물(CMT)을 수득하였다(추출물의 최종 양은 24.70mg ± 0.17mg이다). 2. 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(BMSCs) 배양 본 발명의 프로토콜은 가톨릭대학교 의과대학 서울성모병원의 임상시험연구심사위원회에서 검토 및 승인되었다. 모든 실험은 헬싱키 선언에 명시된 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었다. 도 1에 본 발명에 따른 줄기세포 배양 및 분석방법의 개요를 나타내었다. 치주 치료를 받고 있는 70세 여성 환자로부터 기존의 방식(Ha DH., et al., 2016, Mol Med Rep 14: 69-76.)으로 치은 유래 줄기세포를 획득하였다. 배양 배지를 2일 또는 3일마다 교환하고, 치은 유래 줄기세포를 95% O2 및 5% CO2의 37 배양기에서 증식시켰다. 3. 세포 형태 측정 상기 치은 조직은 즉시 100 U/㎖ 페니실린(시그마 알드리치, 미국) 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(시그마 알드리치, 미국)이 포함된 살균된 인산완충식염수(PBS, Welgene)에 넣어 4℃에 두었다. 상기 치은 조직은 탈-상피화(de-epithelialize)하여 분쇄하였고, 콜라게나아제 Ⅳ(시그마 알드리치)로 소화시킨 후, 5% CO2의 습윤 배양기에서 37℃로 배양하였다. 배양 24 시간 후, 부착되지 않은 세포는 씻어내고, α-MEM 배지를 기본으로 하는 배지로 교체하였다. 상기 배지는 15% 소태아혈청(fetal bovine serum, Gibco), 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 200 mM L-글루타민(시그마 알드리치, 미국) 및 10 mM 아스코르브산 2-인산염(시그마 알드리치, 미국)를 포함한다. 그 이후, 2 ~ 3일 마다 배지를 갈아줌으로써, 인간 치은(gingiva) 유래의 성체줄기세포를 확립하였다. 상기 세포는 콜로니-형성 능력, 부착능(plastic adherence) 및 다양한 계통으로 분화능(골형성, 지방형성, 연골형성)과 같은 줄기세포 특성을 나타내었고, 또한 상기세포는 유동 세포 분석법에 의해 CD44, CD73, CD90 및 CD105는 발현하지만, CD14, CD45, CD34 및 CD19는 발현하지 않는 것이 확인되었다. 상기 줄기세포를 2.0Х103 cells/well의 밀도로 도말하고 골형성 배지(STEMPRO Chondrogenesis Differentiation kit; Gibco)에서 배양하였다. 중대가리풀 추출물(CMT)의 최종 처리농도는 각각 0, 0.001, 0.01, 0.1 및 1 μg/ml이다. 배양 1, 3, 5, 7일자에 역상 현미경(CKX41SF, Olympus Corporation, Tokyo, 일본)을 사용하여 형태학적 평가를 수행하