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KR-102960084-B1 - Composition for treating inflammatory disease comprising N-carbamyl-L-glutamic acid

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Abstract

본 발명은 N-카바밀-L-글루탐산을 생합성하는 방법 및 이의 염증성 질환의 치료 용도에 관한 것이다.

Inventors

  • 손미영
  • 박두상
  • 이하나
  • 최은호

Assignees

  • 한국생명공학연구원

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20230303
Priority Date
20220303

Claims (15)

  1. 락토바실러스 루테리 DS0384 균주를 배양하는 단계;를 포함하는 N-카바밀-L-글루탐산(N-carbamyl-L-glutamic acid)을 생산하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 균주의 배양액을 분리하는 단계;를 더 포함하는 N-카바밀-L-글루탐산(N-carbamyl-L-glutamic acid)을 생산하는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 균주의 배양액에서 N-카바밀-L-글루탐산을 정제하는 단계;를 더 포함하는, N-카바밀-L-글루탐산(N-carbamyl-L-glutamic acid)을 생산하는 방법.
  4. N-카바밀-L-글루탐산(N-carbamyl-L-glutamic acid)을 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환의 치료용 약학적 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 N-카바밀-L-글루탐산은 락토바실러스 루테리 DS0384 균주에 의해 생산된 것인, 조성물.
  6. 삭제
  7. 청구항 4에서, 상기 염증성 장 질환은 궤양성 대장염 또는 크론병인 것인, 조성물.
  8. 청구항 4에서, 상기 N-카바밀-L-글루탐산은 1mM 내지 300mM의 농도로 포함되는 것인, 조성물.
  9. 청구항 4에 있어서, 상기 N-카바밀-L-글루탐산은, iNOs의 발현을 감소시키는 것인, 조성물.
  10. 청구항 4에 있어서, 상기 N-카바밀-L-글루탐산은, ZO-1, CLDN1 및 ECAD으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 것인, 조성물.
  11. 청구항 4에 있어서, 상기 N-카바밀-L-글루탐산은, TNFα, IFNγ, Il-6, Il-8, Il-1β 및 IL-17 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 전염증성 사이토카인의 발현을 감소시키는 것인, 조성물.
  12. 청구항 4에 있어서, 상기 N-카바밀-L-글루탐산은 Fzd7, Tcf7, Ror1 및 Axin2으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 것인, 조성물.
  13. 청구항 4에 있어서, 상기 N-카바밀-L-글루탐산은 VIL1, EPCAM, KRT20, CLAUDIN, MUC2, LYZ 및 Ki-67으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 것인, 조성물.
  14. N-카바밀-L-글루탐산(N-carbamyl-L-glutamic acid)을 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  15. N-카바밀-L-글루탐산(N-carbamyl-L-glutamic acid)을 유효성분으로 포함하는 염증성 장 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물.

Description

N-카바밀-L-글루탐산을 포함하는 염증성 질환의 치료용 조성물{Composition for treating inflammatory disease comprising N-carbamyl-L-glutamic acid} N-카바밀-L-글루탐산을 생합성하는 방법 및 이의 염증성 질환의 치료 용도에 관한 것이다. N-카바밀-L-글루탐산(N-carbamyl-L-glutamic acid, NCG)는 요소 회로에 관여하는 첫 번째 효소인 카르바밀 인산 합성효소-1을 활성화하는 N-아세틸글루타메이트의 대사적으로 안정한 유사체이다. NCG는 동물과 유아에게 독성이 없으며 세포와 미토콘드리아에 쉽게 침투한다. NCG 섭취시, 미성숙한 새끼 동물들의 공장(jejunum)에서 융모의 길이 또는 선와의 깊이가 증가한다는 보고가 있다. 이에 실제 NCG는 젖소, 육우, 신생 돼지 등의 중요한 사료 첨가제로 사용되어 우유 생산량을 늘리고, 임신율을 높이고, 이환율과 사망률을 낮추고, 출생체중과 성장률을 증가시키는 연구 결과가 보고되었다. 한편, 대장은 소화기관의 최고 말단에 존재하는 장기로 물, 비타민, 무기물 등을 흡수하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 대장에서는 유전적, 환경적 요인으로 인해 대장암, 대장용종, 과민성 장증후군, 궤양성 대장염 및 크론병 등의 다양한 질환이 유발된다. 그 중 궤양성 대장염은 만성 염증성 장 질환으로 대장에서 염증반응이 과하게 발생하여 설사, 하복부 통증, 복부 팽만감, 혈변 등의 증상을 주로 나타내며, 현재까지 정확한 발병 원인이 밝혀진 바 없다. 궤양성 대장염은 발병 기간에 따라 만성과 급성으로, 발병 원인을 기준으로 감염성과 비감염성으로 분류된다. 이 질병은 직장 부위에서 염증이 가장 먼저 발생하여 장벽이 무너지고 병원성 세균과 장내 세균이 체 내로 침입하여 면역반응이 과하게 발생하여 대장의 전반부로 그 범위가 확대된다. 궤양성 대장염 환자는 정상에 비해 10~20배 높은 대장암 발생위험을 가지고 있으며, 질병을 앓는 기간 및 부위의 면적이 증가할수록 위험도가 증가된다. 최근 한국을 포함한 아시아 국가에서 발병률이 증가하고 있으나 궤양성 대장염은 발병 후 완치가 불가한 질병으로, 이 질환의 치료 목표는 증상 완화 및 점막의 염증을 호전시켜 환자의 삶의 질을 높이는 것이다. 궤양성 대장염의 환자군은 크게 경증(Mild), 중증도(Moderate) 및 중증(Severe)의 단계로 나뉘며 단계별 표준적 치료가 요구된다. 궤양성 대장염의 경증 및 중증도 환자의 치료에 5-아미노실산(5-aminoslicylic acid, 5-ASA)제제가 사용되고 있으나, 환자의 20 내지 40%에 치료효과가 없거나 부작용이 발생하므로, 새로운 치료제 및 용법 개발이 필요하다. 현재까지 다양한 동물모델을 활용하여 발병 원인과 치료제에 대한 연구가 진행되고 있지만, 염증성 장 질환 중 특히 궤양성 대장염의 발병 원인은 다양하고 복잡한 특징이 있어 치료제 개발에 어려움을 겪고 있다. 따라서 기존 치료제의 부작용과 한계점을 극복할 수 있는 대안적 치료제 개발이 필요한 실정이다. 이러한 배경하에, 본 발명자들은 기존의 염증성 장 질환 치료제의 한계를 극복하기 위해 대안적 치료제를 모색한 결과, 락토바실러스 루테리 DS0384를 이용하여 NCG를 생합성할 수 있고, NCG는 궤양성 대장염 치료제의 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 도 1의 패널 a는 비피도박테리움 롱검(B. longum), 락토바실러스 가세리(L. gasseri), 락토바실러스 커바투스(L. curvatus), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) 및 본 발명의 락토바실러스 루테리 DS0384(L. reuteri) 균주의 배양액을 장 오가노이드에 처리한 다음, 장 오가노이드의 형태학적 변화를 현미경으로 확인한 결과(위쪽 데이터, Bright field, BF) 및 면역형광염색을 통해 성숙 장관 마커 단백질의 발현을 비교하여 나타낸 결과(아래쪽 데이터)이다. 스케일 바는 흑색 500 ㎛, 백색 100 ㎛이다. 도 1의 패널 b는 비피도박테리움 롱검(B. longum), 락토바실러스 가세리(L. gasseri), 락토바실러스 커바투스(L. curvatus), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) 및 락토바실러스 루테리 DS0384(L. reuteri) 균주의 배양액을 장 오가노이드에 처리한 다음, 장 오가노이드의 형태학적 변화를 확인하기 위해 장 오가노이드의 크기 변화(왼쪽 패널) 와 장 오가노이드의 발아(budding) 구조의 개수(오른쪽 패널)를 확인하여 비교한 그래프이다. 도 1의 패널 c는 본 발명의 락토바실러스 루테리 DS0384(L. reuteri) 균주를 처리한 장 오가노이드에서 성숙 장관 마커 유전자(CDX2, DPP4, OLFM4, DEFA5, CREB3L3, KRT20, LYZ, LCT, SLC5A1 및 MUC13)의 발현 수준을 qRT-PCR로 확인하여 대조군의 결과와 비교한 그래프이다. 도 2의 패널 a는 락토바실러스 루테리로 분류되는 DS0191, DS0195, DS0333, DS0354 및 본 발명의 락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 배양액을 장 오가노이드에 처리한 다음, 장 오가노이드의 형태학적 변화를 현미경으로 확인한 결과(위쪽 데이터, Bright field, BF) 및 면역형광염색을 통해 성숙 장관 마커 단백질의 발현을 비교하여 나타낸 결과(아래쪽 데이터)이다. 스케일 바는 흑색 500 ㎛, 백색 100 ㎛이다. 도 2의 패널 b는 성숙 장관 마커 유전자(CDX2, DPP4, OLFM4, DEFA5, CREB3L3, KRT20, LYZ, LCT, SLC5A1 및 MUC13)의 발현 수준을 qRT-PCR로 확인하여 비교한 그래프이다. 도 3의 패널 a는 락토바실러스 루테리로 분류되는 DSP007, DS0337, KCTC3594 및 본 발명의 락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 배양액을 장 오가노이드에 처리한 다음, 장 오가노이드의 형태학적 변화를 현미경으로 확인한 결과(위쪽 데이터, Bright field, BF) 및 면역형광염색을 통해 성숙 장관 마커 단백질의 발현을 비교하여 나타낸 결과(아래쪽 데이터)이다. 스케일 바는 흑색 500 ㎛, 백색 100 ㎛이다. 도 3의 패널 b는 성숙 장관 마커 유전자(CDX2, DPP4, OLFM4, DEFA5, CREB3L3, KRT20, LYZ, LCT, SLC5A1 및 MUC13)의 발현 수준을 qRT-PCR로 확인하여 비교한 그래프이다. 도 4는 락토바실러스 루테리 DS0384 균주를 각각 6시간, 12시간, 18시간 및 24시간 배양한 후 수득한 배양액을 장 오가노이드에 처리한 다음, 장 오가노이드의 형태학적 변화(스케일 바는 500 ㎛, 위쪽 패널) 및 배양 시간 별로 수득한 상기 락토바실러스 루테리 균주의 배양액을 처리한 장 오가노이드에서 나타나는 장 성숙 마커 유전자의 발현 양상을 qRT-PCR을 통해 확인하여 비교한 그래프이다(중간 패널). 또한, 장 오가노이드의 형태학적 변화를 확인하기 위해 장 오가노이드의 크기 변화를 표면적으로 비교한 결과와 장 오가노이드의 발아(budding) 구조의 개수 비교한 그래프이다(아래쪽 패널). 도 5는 모세관 전기영동 질량 분석기를 이용하여 락토바실러스 루테리 DS0384 균주 배양액에 포함된 대사산물을 히트맵으로 나타낸 결과로서, KCTC3594 균주에서는 나타나지 않는 14개의 대사산물은 붉은 색으로 표시하였다. 도 6의 패널 a는 락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 배양액에만 동종 균주 대비 더 포함된 대사산물 중 차등적으로 많이 포함된 7개의 대사산물의 장 성숙 및 장 발달 효과를 장 오가노이드의 형태학적 변화를 현미경으로 확인한 결과(위쪽 데이터, Bright field, BF) 및 면역형광염색을 통해 성숙 장관 마커 단백질의 발현을 비교하여 나타낸 결과(아래쪽 데이터)이고, 도 6의 패널 b는 성숙 장관 마커 유전자(CDX2, DPP4, OLFM4, DEFA5, CREB3L3, KRT20, LYZ, LCT, SLC5A1 및 MUC13) 유전자의 발현 양상을 qRT-PCR을 통해 확인하여 비교한 그래프이다. 도 7은 NCG가 락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 배양액과 유사한 수준으로 장관 성숙 및 장관 발달을 촉진하는 것을 장 오가노이드의 형태학적 변화를 현미경으로 확인한 결과(왼쪽 데이터, Bright field, BF) 및 면역형광염색을 통해 성숙 장관 마커 단백질의 발현을 비교하여 나타낸 결과(오른쪽 데이터)이다. 도 8은 NCG가 락토바실러스 루테리 DS0384 균주의 배양액과 유사한 수준으로 장관 성숙 및 장관 발달을 촉진하는 것을 확인하기 위해 장 오가노이드의 형태학적 변화는 장 오가노이드의 크기 변화와 장 오가노이드의 발아(budding) 구조의 개수를 확인한 그래프(위쪽 패널) 및 장관 성숙 마커의 발현 양상을 qRT-PCR로 비교한 결과를 나타낸 것이다(아래쪽 패널). 도 9a는 NCG 궤양성 대장염으로부터 보호 효능을 확인하기 위한 장 오가노이드 실험의 개략도로서, 궤양성 대장염의 대표 전염증성 사이토카인 (Ifnγ, Tnfα; I/T)를 처리하여 장내 염증과 유사한 장 오가노이드에 NCG를 동시 처리하여 장 오가노이드 상피세포의 표현형을 관찰한 실험을 나타낸 것이다. 도 9b는 NCG 궤양성 대장염 장 보호 효능을 확인하기 위한 실험에서, 정상 장 오가노이드, 대장염 유사 장 오가노이드, NCG 처리 장 오가노이드의 형태학적 변화를 나타낸 것이다. 도 9c는 대장염 유사 장 오가노이드 및 NCG 처리 장 오가노이드의 형태학적 변화를 확인하기 위해 장 오가노이드의 크기 변화(왼쪽 패널) 와 장 오가노이드의 발아 구조의 개수 변화(오른쪽 패널)을 확인하여 비교한 그래프이다. 도 9d는 대장염 유사 장 오가노이드 및 NCG 처리 장 오가노이드의 조직학적 형태 분석(H&E 염색)과 뮤신 염색(Alcian Blue-Periodic Acid Schiff staining; AB-PAS staining)을 통해 통해 뮤신을 분비하는 배상세포 및 장의 기능성을 확인한 결과이다. 도 9e는 면역형광염색을 통해 NCG 동시처리를 통해 대장염 유사 장 오가노이