KR-102960585-B1 - Screening method for composition for preventing or treating respiratory diseases

Abstract

본 발명은 호흡기 질환 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따라 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 조성물 후보 물질을 개체에 처리 전 및 처리 후, 호흡기 내 마이크로바이옴의 군집 변화를 측정하여 호흡기 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물을 스크리닝할 수 있다.

Inventors

• 장안수
• 백애린
• 이푸른하늘
• 안민혁
• 황다연

Assignees

• 순천향대학교 산학협력단

Dates

Publication Date

20260506

Application Date

20230726

Claims (6)

1. 호흡기 질환 예방 또는 치료용 조성물 후보 물질을 인간이 아닌 대상체에게 투여하는 단계; 상기 후보 물질 처리 전 및 처리 후 대상체로부터 채취한 호흡기 유래 시료에서 미생물 군집(community)의 다양성을 측정하여 비교하는 단계; 및 상기 후보 물질 처리 전 및 처리 후 대상체로부터 채취한 호흡기 유래 시료에서 얻어진 미생물 게놈 DNA로부터 락토바실러스 살리바리우스( Lactobacillus salivarius ) 종, 콜린셀라 에어로파치엔스( Collinsella aerofaciens ) 종, 비피도박테리움 아돌센티스( Bifidobacterium adolescentis ) 종, 비피도박테리움 롱검( Bifidobacterium longum ) 종, 블라우티아( Blautia ) 속, 장내세균 과( Enterobacteriaceae ), 라크노스피라 과( Lachnospiraceae ), 코리네박테리움 튜버큘로스티리쿰( Corynebacterium tuberculostearicum ) 종, 및 푸소박테리움 페리돈티쿰( Fusobacterium peridonticum ) 종으로 이루어진 그룹에서의 미생물의 증감을 비교하여, 상기 락토바실러스 살리바리우스( Lactobacillus salivarius ) 종, 콜린셀라 에어로파치엔스( Collinsella aerofaciens ) 종, 비피도박테리움 아돌센티스( Bifidobacterium adolescentis ) 종, 비피도박테리움 롱검( Bifidobacterium longum ) 종, 블라우티아( Blautia ) 속, 장내세균 과( Enterobacteriaceae ), 및 라크노스피라 과( Lachnospiraceae ) 미생물이 감소되어 있는 경우, 및 상기 코리네박테리움 튜버큘로스티리쿰( Corynebacterium tuberculostearicum ) 종 및 푸소박테리움 페리돈티쿰( Fusobacterium peridonticum ) 종 미생물이 증가되어 있는 경우에 상기 후보 물질을 호흡기 질환 예방 또는 치료용 조성물로 판단하는 단계;를 포함하는 호흡기 질환 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법에 있어서, 상기 호흡기 질환은 미세먼지에 의한 천식인 것인, 호흡기 질환 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 미생물 군집(community)의 다양성을 측정하여 비교하는 단계는 Chao1 index, OTUs index, Shannon index 및 Simpson index로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상의 지수(index)를 사용하여 미생물 군집(community)의 다양성을 측정하여 비교하는 것인, 호흡기 질환 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 후보 물질을 호흡기 질환 예방 또는 치료용 조성물로 판단하는 단계 상기 미생물에 특이적인 프라이머(primer), 프로브(probe), 안티센스 올리고 뉴클레오티드(antisense oligo nucleotide), 압타머(aptamer) 또는 항체(antibody)로 검출하여 증감을 비교하는 것인, 호흡기 질환 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 프라이머(primer)는 상기 미생물의 16S rRNA를 증폭할 수 있는 것인, 호흡기 질환 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법.
5. 삭제
6. 삭제

Description

호흡기 질환 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법 {Screening method for composition for preventing or treating respiratory diseases} 본 발명은 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 후보 물질을 대상체에 처리 전 및 처리 후, 호흡기 내 마이크로바이옴의 군집 변화를 측정하여 호흡기 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물을 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다. 미세먼지는 매우 복잡한 성분을 가진 대기 중에 부유하는 미세입자로, 미세먼지의 노출은 호흡기 및 심혈관계질환의 발생 뿐만 아니라 사망률을 증가시킨다고 알려져 있다. 일반적으로 미세입자의 직경은 0.1 내지 2.5㎛이며, 극미세입자는 직경이 0.1㎛ 미만인 물질을 의미한다. 미세먼지 조성은 매우 다양하며, 주로 탄소성분(유기탄소, 원소탄소), 이온성분(황산염, 질산염, 암모늄), 광물성분 등으로 구성되어 있다. 미세먼지는 주로 세기관지에서 염증 반응을 일으키며, 이러한 작용은 천식, 만성 폐쇄성 폐질환 등 만성 호흡기 질환을 일으키거나 악화시키는 것으로 알려져 있다. 만성 호흡기 질환은 기도의 염증 반응으로 인해, 기도 점막에 부종이 발생하며 기도가 수축되고 폐쇄되어 천명, 호흡 곤란, 기도 폐쇄, 폐동맥 고혈압 등이 나타난다. 한편, 마이크로바이옴(microbiome)은 사람의 장, 호흡기, 피부, 생식기 등의 인체 상피 세포에 주로 존재하는 모든 미생물들과 이들의 유전정보 전체를 말하는 것으로 단일생명체의 유전정보 전체를 뜻하는 게놈들의 집합체를 의미한다. 이러한 마이크로바이옴은 그 구성에 따라 인간의 건강에 영향을 미치는 것으로도 알려져 있다. 인체에 서식하는 미생물은 인체에 해를 끼치지 않는 공생균이 대부분이며 이중 일부는 병원균의 성장을 억제하거나, 인간 세포가 만들 수 없는 대사물질을 생성하는 등 유익한 균이다. 하지만 특정 신체 부위에서는 일반 공생균으로 존재하지만 컨디션 및 신체 부위 등의 환경조건에 따라서 병원성을 나타내는 유해균(pathobiont) 역시 존재한다. 최근 유전자 서열분석 기술이 발달하면서, 인체 내 다양한 부위에서 인간 마이크로바이옴(microbiome)에 대한 측정이 가능해졌다. 환경 미생물은 만성 폐 질환의 보호 및 유해 효과와 모두 관련이 있으며, 흡입된 오염 물질을 대사 시키거나, 노출에 대한 염증 반응을 조절할 수 있다. 따라서, 미생물 군집의 생화학적 및 면역학적 프로파일은 폐 또는 기관지 환경의 지표가 될 수 있다. 다만, 장내 미생물이 건강에 미치는 영향에 대해서는 상대적으로 연구가 활발하나, 오염 물질 등의 흡입으로 유발되는 호흡기 질환에서 미생물의 역할은 대체로 알려져 있지 않으므로 이에 대한 연구가 필요한 실정이다. 도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라, 마우스에 Ovalbumin(OVA)를 처리하여 천식을 유도하고, 이산화타이타늄(TiO2)을 노출시킨 후 브롱코박솜을 투여하여 각 군별 마우스 모델을 제작한 모식도를 나타낸 것이다. 도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따라, 각 군별 마우스에 대하여 메타콜린에 의한 기도 과민성을 측정한 결과 그래프를 나타낸 것이다. 도 2b은 본 발명의 일 실시예에 따라, 각 군별 마우스에서 기관지 세척액을 수집한 후, 염증 세포의 수를 측정한 결과 그래프를 나타낸 것이다. 도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따라, 각 군별 마우스에서 키트를 사용하여 염증과 관련된 사이토카인의 발현량을 측정한 결과 그래프를 나타낸 것이다. 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라, 각 군별 마우스 모델에 대하여 조직 염색(H&E)을 통하여 폐 조직의 염증을 측정한 결과 사진(3a) 및 그래프(3b)를 나타낸 것이다. 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라, 각 군별 마우스 모델에 대하여 마이크로바이옴 군집의 다양성을 측정하여 지표(index)에 따른 결과 그래프를 나타낸 것이다. 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라, 각 군별 마우스 모델에 대하여 마이크로바이옴 군집의 구성 및 구조를 Phylum(5a), Genus(5b) 및 Species(5c) 별로 측정한 그래프를 나타낸 것이다. 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라, 각 군별 마우스 모델에 대하여 Taxonomic Biomarker(6a 및 6b), 유산균(6c) 및 인간 소장 미생물(6d)의 증가 또는 감소하는 경향을 측정하여 비교 분석한 결과 그래프를 나타낸 것이다. 이하 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 도면을 참고하여 구체적으로 설명한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 따로 정의하지 않는 한, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 내용으로 해석되어야 할 것이다. 본 명세서의 도면 및 실시예는 통상의 기술자가 본 발명을 쉽게 이해하고 실시하기 위한 것으로 도면 및 실시예에서 발명의 요지를 흐릴 수 있는 내용은 생략될 수 있으며, 본 발명이 도면 및 실시예로 한정되는 것은 아니다. 본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다. 실시예 1: 천식군, 미세먼지 노출 천식군, 및 브롱코박솜 처리군 마우스 모델 제작 일반적으로 마우스에 Ovalbumin(이하, OVA)을 처리하면 천식이 유도된다고 알려져 있다. 이에, 암컷 BLAB/c 마우스(나라바이오텍, 군(Group)당 6 마리)에 대하여 1일째와 14일째에 천식군, 미세먼지 노출 천식군 및 브롱코박솜 처리군 모두에게 OVA 복강 투여를 진행하였다. 그리고, 미세먼지 노출 천식군 및 브롱코박솜 처리군에게 21일 내지 23일째에 OVA를 비강 투여하고 1시간 후, 이산화타이타늄(TiO2) 입자 (1시간 동안 200 ㎍/m3)에 흡입 노출시켰다. 또한, 브롱코박솜 처리군은 브롱코박솜을 8.5 mg/kg 경구 투여하여 각 군별 마우스 모델을 제작하였으며, 이를 도 1에 나타내었다. 실시예 2: 기도 과민성, 염증 세포의 수 및 사이토카인의 발현량 측정 상기 실기예 1에서 제작된 천식군, 미세먼지 노출 천식군 및 브롱코박솜 처리군 마우스 모델에 대하여 기도 과민성, 염증 세포의 수 및 염증과 관련된 사이토카인(cytokine)의 발현량을 각각 측정하였다. 기도 과민성은 구체적으로, 25일째 flexiVent(Scireq, US)를 사용하여 각 군별 마우스에 대하여 메타콜린에 의한 기도 과민성(Airwayhyperresponsiveness, AHR)을 측정하여 기능적인 변화를 평가하였다. 즉, 각 군별 마우스에 다양한 농도(0 mg/mL,6.25 mg/mL, 12.5 mg/mL 및 50 mg/mL)로 에어로졸 메타콜린(methacholine)을 투여한 후 흡입된 메타콜린에 대한 최고 기도반응을 측정하였으며, 그 결과를 도 2a 및 하기 표 1에 나타내었다. 기도 과민성 측정 결과0 mg/ml6.25 mg/ml12.5 mg/ml50 mg/ml천식군1.7422.9234.8647.810미세먼지노출 천식군2.4464.3305.8409.495브롱코박솜 처리군2.0513.5654.9636.328 실험결과, 도 2a 및 상기 표 1에 제시된 바와 같이, 미세먼지 노출 천식군 대비 브롱코박솜 처리군의 경우 메타콜린에 대한 기도 과민성이 감소한 것을 확인하였다. 특히, 메타콜린의 흡입 농도가 12.5 mg/ml을 초과하는 경우에는 천식군 보다 브롱코박솜 처리군의 기도 과민성이 더 감소한 것을 확인할 수 있다. 그리고, 염증 세포의 수는 구체적으로, 25일째 각 군별 마우스의 양쪽 폐에 1.05X 인산염 완충 식염수(PBS)를 넣고 부드럽게 흡입하여 기관지 세척액(bronchial airway lavage, BAL)을 수집하고 분석하였다. 총 세포 수는 혈구계산판(hemocytometer)를 이용하였으며, 세포 감별 계산(differential cell count)은 세포원심분리기(cytocentrifugation) 및 Diff-Quik 염색(Dade Diagnostics, Deerfield, IL)을 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 2b 및 하기 표 2에 나타내었다. 염증 세포의 수 측정 결과(Cell number x 104 ml BALF)total cellsmacrophageseosinophilsneutrophilslymphocytes천식군6.8143.8742.9450.1920.102미세먼지노출 천식군12.0864.1345.5612.1280.261브롱코박솜 처리군8.9876.2932.3630.2600.070 실험결과, 도 2b 및 표 2에 제시된 바와 같이, 미세먼지 노출 천식군 대비 브롱코박솜 처리군의 경우 대식 세포(macrophage)를 제외한 전체 세포(total cells), 호산구(eosinophils), 호중구(neutrophils) 및 림프구(lymphocytes) 등 염증 세포의 수가 현저하게 감소한 것을 확인하였다. 또한, 염증과 관련된 사이토카인의 발현량은 구체적으로, 각 군별 마우스에서 IL-4, IL-5, TNF-α 및 IL-1β 사이토카인의 발현량을 키트(R&D Systems)를 사용하여 제조업체의 권장 사항에 따라 측정하였으며, 그 결과를 도 2c 및 하기 표 3에 나타내었다. 사이토카인의 발현량 측정 결과(pg/ml)IL-4IL-5TNF-αIL-1β천식군44.4513.9993.8641.335미세먼지노출 천식군126.1699.6054.8133.812브롱코박솜 처리군71.4240.3204.0940.265 실험결과, 도 2c 및 상기 표 3에 제시된 바와 같이, 미세먼지 노출 천식군 대비 브롱코박솜 처리군의 경우, 염증 관련 사이토카인의 발현량이 현저하게 감소한 것을 확인하였다. 정리하면, 미세먼지 노출 천식 마우스 모델에 대하여, 브롱코박솜을 처리하는 경우 기도 과민성이 감소하고, 염증 세포의 수 및 염증 관련 사이토카인의 발현량이 감소하여 항염증 효과가 있음을 시사한다. 실시예 3: 조직 염색을 통한 염증 확인 상기 실기예 1에서 제작된