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KR-102960647-B1 - Extracelluar vesicle derived from stem cell and uses thereof

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Abstract

본 발명은 줄기세포 유래 세포외 소포체 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 줄기세포 유래 세포외 소포체는 COL6A1, COL6A3, TNC, EIF4E, HSP90AB1, HSP90B1, RAC1, TGF-β1 및 TGM2 중에서 선택되는 1종 이상의 단백질을 고발현함으로써 TNF-α, IL-6 등의 염증성 사이토카인의 양을 현저히 감소시키므로, 다양한 염증 질환의 예방, 완화, 개선 또는 치료에 효과적이다. 특히, 본 발명의 줄기세포 유래 세포외 소포체는 간질성 방광염/방광통증 증후군(IC/BPS) 동물모델에 투여하는 경우, IC/BPS 유도 과정에서 무너진 방광 내벽이 회복되고, 염증 정도가 완화되며, 방광 내압이 회복되고, 대조군과 유사한 배뇨 주기를 나타내므로, 간질성 방광염/방광통증 증후군에 대하여 우수한 치료 효능이 있다. 또한, 본 발명의 줄기세포 유래 세포외 소포체는 세포의 이동(migration)을 현저히 증가시키며, 상처 치유 효과가 우수하므로, 상처치유용으로 유용하게 이용될 수 있다.

Inventors

  • 조쌍구
  • 임경민
  • 아브달아메드
  • 이수빈
  • 최유진
  • 강근호
  • 김아람

Assignees

  • 건국대학교 산학협력단
  • 건국대학교 글로컬산학협력단
  • 스템엑소원 주식회사

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20220125
Priority Date
20210706

Claims (16)

  1. 줄기세포 유래 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 방광염의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 상기 줄기세포 유래 세포외 소포체는, (a) 대상체로부터 분리된 줄기세포를 배양하여 세포 응집체(cell aggregate)를 형성하는 단계; 및 (b) 상기 세포 응집체를 TGF-β(Transforming growth factor beta)를 포함하는 배양액에서 3차원 배양하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조된 것으로, TNC, EIF4E, RAC1 및 TGF-β1 중에서 선택되는 1종 이상의 단백질을 2차원 배양한 줄기세포 유래 세포외 소포체, 또는 배양액에 TGF-β를 첨가하지 않고 3차원 배양한 줄기세포 유래 세포외 소포체에 비해 고발현하는 것임을 특징으로 하는 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 고발현되는 단백질은, TNC, EIF4E, RAC1 및 TGF-β1인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 고발현되는 단백질은, TGF-β1인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 줄기세포 유래 세포외 소포체는, TGF-β1을 50 내지 1,000 pg/1x10 9 particles의 양으로 발현하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 고발현되는 단백질은, COL6A1, COL6A3, TNC, EIF4E, HSP90AB1, HSP90B1, RAC1, TGF-β1 및 TGM2인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)는 다중 웰(multi-well) 배양 용기에서 줄기세포를 부유 배양(suspension culture)함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 TGF-β는 TGF-β3인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 단계 (b)는 상기 세포 응집체를 부유 상태에서 회전 진탕 배양(orbital shaking culture)함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 회전 진탕 배양은 50 - 70 rpm의 회전속도로 수행되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포 유래 세포외 소포체는 30 내지 150 nm의 평균 직경을 가지는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제1항에 있어서, 상기 방광염은 간질성 방광염(Interstitial Cystitis), 만성 방광염 및 케타민 유발 방광염 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  16. 삭제

Description

줄기세포 유래 세포외 소포체 및 이의 용도{Extracelluar vesicle derived from stem cell and uses thereof} 본 발명은 줄기세포 유래 세포외 소포체 및 이의 용도에 관한 것이다. 일반적으로 염증반응은 생체의 세포나 조직에 기질적 변화를 가져오는 침습으로 인한 손상을 수복 및 재생하기 위한 생체방어 반응과정이고, 이 반응과정에는 국소의 혈관, 체액의 각종 조직세포 및 면역세포 등이 작용한다. 정상적으로 외부 침입균에 의하여 유도되는 염증반응은 생체를 보호하기 위한 방어 시스템인 반면, 비정상적으로 과도한 염증반응이 유도되면 다양한 질환들이 나타나게 되는데, 이러한 질환들을 염증질환이라 총한다. 상기 염증질환은 외부자극에 의하여 활성화된 표적세포로부터 분비되는 다양한 염증 매개물질이 염증을 증폭 및 지속시켜 인체의 생명을 위협하는 질환으로서 급성염증, 방광염과 같은 방광 내에서의 질환, 류마티스관절염과 같은 관절 내에서의 질환, 건선 등의 형태로 나타나는 피부질환 및 기관지 천식 등의 알러지성 염증질환 등을 포함한다. 특히, 간질성 방광염(IC)은 통증, 예를 들면 골반통의 증후, 및 하부 요로 증후군(LUTS), 예를 들면 증가된 빈뇨/절박뇨를 특징으로 하는, 원인이 밝혀지지 않은 만성 방광 질환이다. 보다 최근의 용어는 이 복합 증후를 집합적으로 개시하기 위해 IC와 함께 통증성 방광 증후군(PBS)([MacDiarmid SA et al. Rev Urol 2007; 9(1): 9-16]) 또는 방광 통증 증후군(BPS)([(van der Merve et al. European Urology 53(2008) 60-67])를 포함하는 것으로, 즉 IC/BPS 또는 IC/PBS/BPS로 변화되고 있다. IC/PBS/BPS의 유병률은 임상적으로 확인된 질병을 갖는 100,000명의 여성당 67 내지 230명으로 다양하며, 흔히 자궁내막염, 재발성 요로 감염, 과민성 방광 또는 외음부 통증으로 잘못 진단되거나 저진단되기 때문에 이 수치는 아마도 더 높을 것이다(Forrest J B et al. Clinical Courier 2006; 24(3):1-8). IC는 삶의 질에 상당한 영향을 미치고, 여행, 가족관계 및 활동에 영향을 미치고(Slade D et al. Urol 1997; 49 (5A Suppl):10-3), 또한 우울성 증후군과 관련되어 있다(Rothrock N E et al. J Urol 2002; 167: 1763-1767). 상기 IC/PBS/BPS는 단일한 병인이 확인되지 않았고, 주로 통각과민, 만성 방광 통증 및 배뇨 장애를 일으킨다(Forrest J B et al. Clinical Courier 2006; 24(3):1-8). 세포외 소포체는 인간과 동물은 물론, 곤충, 식물, 미생물 등 다양한 진핵 세포에서 분비되는 다양한 크기의 지질 이중막 구조의 소포체로서, 이 중 나노수준의 입경을 가지는 미세 소포체를 엑소좀(exosome)이라 한다. 엑소좀은 세포가 함유하는 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물 등 특정 분자들을 포함하면서, 지질 이중층으로 이들 분자들을 안정적으로 보호하고 분비 후 다른 세포로 이들을 전달하는 정보 전달 역할을 한다. 엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중 인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 세포외 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579). 그러나, 엑소좀을 이용한 일부 질환의 치료에 대한 가능성 제시 등 다양한 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고, 보다 면밀한 임상 및 비임상 연구가 필요하며, 특히 엑소좀이 작용하는 다양한 표적을 과학적으로 규명하여 엑소좀을 다양한 질환 치료에 응용할 수 있는 기술의 개발이 필요한 실정이다. 이에 본 발명자들은 줄기세포로부터 유래된 엑소좀의 새로운 용도에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, 줄기세포 배양액으로부터 분리된 엑소좀이 COL6A1, COL6A3, TNC, EIF4E, HSP90AB1, HSP90B1, RAC1, TGF-β1 및 TGM2 중에서 선택되는 1종 이상의 단백질을 고발현하면 줄기세포 자체나 줄기세포 배양액의 안전성 문제를 해결할 수 있고, 간질성 방광염을 포함한 다양한 염증 질환의 예방, 완화, 개선 또는 치료에 효과적임을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 도 1은 본 발명의 방법에 따른 중간엽 줄기세포 3차원 배양과정을 나타낸 그림으로, 세포응집체 형성(도 1a) 및 회전 교반기를 이용한 3D 배양(도 1b) 과정을 각각 보여준다. 도 2는 각 배양조건에 따른 엑소좀의 수율을 나타낸 그림이다. 도 3은 TGF-β 처리에 의한 PDI 값의 변화를 나타내는 그림으로, TGF-β를 처리한 3D 진탕 배양 조건에서는 단일 피크(one peak)가 나타남을 보여준다. 도 4는 TGF-β가 T 세포 증식에 미치는 영향을 보여주는 그림이다. 각각 PHA를 이용하여 PBMC의 증식을 유발한 뒤 음성 대조군(무처리군), 양성 대조군(MSC 처리군), 3D 진탕 배양 조건만을 적용한 엑소좀(3D-EV), 3D 진탕 배양 조건 하에서 TGF-β3를 배양액에 첨가하여 얻어진 엑소좀(T-3D-EV)의 T 세포 억제효과를 확인하였다(도 4a). 그 결과, TGF-β를 처리한 3D 진탕 배양 조건을 통해 수득한 엑소좀(T-3D-EV)이 가장 현저한 T 세포 억제 효과를 가지는 것으로 확인되어(도 4b 및 4c), 본 발명의 방법으로 인해 수득된 엑소좀은 수율 뿐 아니라 기능도 강화되었음을 보여준다. 도 5a는 동적 광산란(dynamic light scattering, DLS) 분석을 통해 엑소좀의 크기를 조사한 결과를 보여주는 그림이다. 도 5b는 엑소좀의 형태 및 구조를 투과전자현미경(TEM)으로 관찰한 결과이다. 도 5c는 CD9, CD63, Flotillin-1 및 Alix의 발현을 확인하기 위한 웨스턴 블롯팅 분석 결과를 나타낸다. 도 5d는 유세포 분석을 통해 엑소좀 표면의 면역 표현형 분석을 수행한 결과를 보여준다. 도 5e는 생산된 엑소좀의 TGF-β1 함유량을 효소결합면역흡착검사(ELISA)를 통해 확인한 결과를 나타낸다. 도 6은 트랜스웰 이동 분석을 통해 인간섬유아세포(NHDF)에서 엑소좀 투여에 따른 세포 이동 능력 증가를 확인한 결과를 보여주는 사진이며(왼쪽), 오른쪽은 Image J를 이용하여 상대적인 염색정도를 수치화하여 표현한 그래프이다. 도 7은 생검펀치로 상처를 생성한 동물모델에 엑소좀을 투여하여 시간 경과에 따른 상처 치유능을 확인한 결과를 보여주는 그림이다. 도 7a는 생검펀치로 상처를 생성한 동물모델에 엑소좀을 투여한 후 일정 시간마다 상처 부위를 촬영한 사진이다. 도 7b는 도 7a의 상처 부위의 크기를 도시화하여 그래프로 나타낸 것이다. 도 8은 생검펀치로 상처를 생성한 동물모델에 엑소좀을 투여하여 시간 경과에 따른 상처 치유능을 확인하면서 상처 유발 9일 후 상처 유발 부위의 조직학적 분석을 수행한 결과이다. 도 9는 Raw264.7 세포에서 LPS로 유도된 염증반응이 엑소좀의 투여에 의해 유의적으로 감소한 것을 확인한 결과이다. 도 10은 LPS 및 엑소좀을 함께 투여하여 배양한 Raw264.7 세포의 배양액 상층액 내에서 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6의 농도가 현저히 감소한 것을 확인한 결과이다. 도 11은 LPS 독소로 인한 내독소혈증 마우스 모델에서 엑소좀 투여에 따른 TNF-α 및 IL-6 감소 효과를 확인한 결과를 보여주는 그림이다. 도 12는 SV-HUC-1(인간요로상피세포)에 엑소좀을 농도별로 처리하여 세포 증식을 확인한 결과를 보여주는 그림이다. 도 12a는 SV-HUC-1에 엑소좀을 농도별로 처리한 후 세포 증식율을 나타낸 그래프이고, 도 12b는 세포 증식과 연관된 P-AKT와 P-ERK의 발현량을 확인한 결과이다. 도 13은 트랜스웰 이동 분석을 통해 인간요로상피세포(SV-HUC-1)에서 엑소좀 투여에 따른 세포 이동 능력 증가를 확인한 결과를 보여주는 그림이다. 도 13a는 Crystal violet 염색을 통해 트랜스웰의 반대편으로 이동한 세포를 시각적으로 확인한 사진이다. 도 13b는 도 13a의 Image J를 이용하여 나타낸 상대적인 세포 컨플루언시를 도시화하여 그래프로 나타낸 것이다. 도 14는 간질성 방광염/방광통증 증후군(IC/BPS) 유도 마우스 모델을 제조하고, 엑소좀 투여에 따른 치료 효과를 평가하기 위한 시험 디자인 개요도이다. 도 15는 간질성 방광염/방광통증 증후군(IC/BPS) 유도 마우스 모델에서 엑소좀 투여 후 방광 조직의 형태 및 염증 정도를 확인한 그림이다. 도 15a는 IC/BPS 마우스 모델의 방광 조직을 H&E 염색한 결과이고, 도 15b는 masson’s trichome 염색한 결과이며, 도 15c는 toluidine blue 염색한 결과이고, 도 15d는 상기 염색을 통해 Fibrosis 정도와 Mast cell의 침투를 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 도 16은 간질성 방광염/방광통증 증후군(IC/BPS) 유도 마우스 모델에서 엑소좀 투여 후 추출된 방광 조직에서 mRNA를 추출하여, 염증 관련 사이토카인(TNFα, IL6)의 발현량(도 16a), 요로상피 마커(UPK1A, UPK1B, UPK2)의