KR-102960809-B1 - 항박테리아제 및 방법

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Abstract

본 발명은 박테리아 사이의 접합을 수행하기 위한 수단에 관한 것이고, 특히 본 발명은 항미생물제를 포함하는 담체 박테리아 및 사용 방법에 관한 것이다. 담체 박테리아는 표적 세포로의 작용제를 코딩하는 DNA의 접합 전달이 가능하다. 본 발명은 추가로 동물에서 성장 또는 사료 전환율 촉진에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 살모넬라를 사멸시키거나 살모넬라의 성장 또는 증식을 억제하는 것에 관한 것이다.

Inventors

우드워드, 마틴
코건, 트리스탄
푸크스, 에드워드
크네우퍼, 홀거
리씨오, 알레산드로
그론달, 크리스티안
클럽, 재스퍼

Assignees

포리움 푸드 사이언스 리미티드

Dates

Publication Date: 20260506
Application Date: 20200510
Priority Date: 20190512

Claims (20)

가축 동물의 성장 또는 중량을 증진시키기 위한 비의학적 방법으로서, 여기서 방법은 복수의 이. 콜라이( E. coli ) 담체 세포를 동물에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 동물은 박테리아 표적 세포를 포함하고, 이. 콜라이 담체 세포 각각은 표적 세포에 독성이 있지만 이. 콜라이 담체 세포에는 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하는 제1 에피솜 DNA를 포함하고, 이. 콜라이 담체 세포는 표적 세포에서의 항박테리아제의 발현을 위해 제1 에피솜 DNA의 표적 세포로의 접합 전달이 가능하며, 여기서 제1 에피솜 DNA는 표적 세포에서의 발현을 위해 이. 콜라이 담체 세포에서 표적 세포로 전달되어 항박테리아제를 생성함으로써 동물에서 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 감소시키고 동물의 성장 또는 중량을 증진시키고, 여기서 표적 세포는 살모넬라 엔테리카( Salmonella enterica ) 세포를 포함하고; 항박테리아제는 (i) 표적 염색체 핵산 서열을 인식 및 변형시킬 수 있는 가이드된 뉴클레아제로서, 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 억제하도록 염색체를 변형시키는 것인, 가이드된 뉴클레아제를 포함하고, (ii) 표적 세포에 포함된 염색체 프로토스페이서 서열을 절단하도록 표적 세포에서 Cas 뉴클레아제와 함께 작동하는 CRISPR/Cas 시스템의 가이드 RNA 또는 crRNA를 코딩하며, 여기서 프로토스페이서 서열은 유전자 invB , sseE , 및 sicP 의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 방법이 동물에서 사료 전환율 (FCR)을 개선시키는 것인 방법.
제2항에 있어서, 표적 세포가 에스 엔테리카 아종 엔테리카를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 복수의 상이한 에스 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형을 사멸시키며; 임의로 여기서 각 혈청형이 티피뮤리움(Typhimurium), 엔테리티디스(Enteritidis), 비르효(Virchow), 몬테비데오(Montevideo), 하이델베르크(Heidelberg), 하다르(Hadar), 빈자(Binza), 브레데니(Bredeney), 인판티스(Infantis), 켄터키(Kentucky), 세프텐베르크(Seftenberg), 엠반다카(Mbandaka), 아나툼(Anatum), 아고나(Agona) 및 더블린(Dublin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 이. 콜라이 담체 세포가 F18, 니슬(Nissle) 또는 S17 이 콜라이 세포인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 동물의 위장관에서 표적 세포를 감소시키며; 임의로 여기서 동물이 조류이고 방법이 조류의 맹장, 소낭, 간, 비장 및/또는 회장에서 표적 세포를 감소시키는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 DNA가 플라스미드에 포함되며, 여기서 플라스미드가 RP4 전달 기점 (oriT) 및/또는 p15A ori를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포는 에스 엔테리카의 제1 및 제2 균주를 포함하고, 각 균주는 프로토스페이서 서열을 포함하며, 균주의 표적 세포는 사멸되는 것인 방법.
제1항의 방법에서 사용하기 위한 담체 세포로서, 여기서 담체 세포는 박테리아 표적 세포에 독성이 있지만 담체 세포에는 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하는 제1 에피솜 DNA를 포함하는 박테리아 세포이고, 담체 세포는 표적 세포에서의 항박테리아제의 발현을 위해 DNA의 표적 세포로의 접합 전달이 가능하게 하여 표적 세포를 사멸시키며, 여기서 표적 세포는 살모넬라 엔테리카 세포이고, 담체 세포는 이. 콜라이 세포이며, 여기서 항박테리아제는 (i) 표적 염색체 핵산 서열을 인식 및 변형시킬 수 있는 가이드된 뉴클레아제로서, 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 억제하도록 염색체를 변형시키는 것인, 가이드된 뉴클레아제를 포함하고, (ii) 표적 세포에 포함된 염색체 프로토스페이서 서열을 절단하도록 표적 세포에서 Cas 뉴클레아제와 함께 작동하는 CRISPR/Cas 시스템의 가이드 RNA 또는 crRNA를 코딩하고, 여기서 프로토스페이서 서열은 유전자 invB , sseE , 및 sicP 의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 담체 세포.
병원성 박테리아 표적 세포에 의한 감염을 치료하기 위해 가축 동물에게 담체 세포를 투여하는 것을 포함하는 방법에서 사용하기 위한 복수의 담체 세포를 포함하는 조성물로서, 여기서 담체 세포 각각은 표적 세포에 독성이 있지만 담체 세포에는 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하는 제1 에피솜 DNA를 포함하는 박테리아 세포이고, 담체 세포는 표적 세포에서의 항박테리아제의 발현을 위해 제1 에피솜 DNA의 표적 세포로의 접합 전달이 가능하며, 여기서 제1 에피솜 DNA는 표적 세포에서의 발현을 위해 담체 세포에서 표적 세포로 전달되어 항박테리아제를 생성함으로써 가축 동물에서 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 감소시키며, 여기서 표적 세포는 살모넬라 엔테리카 세포이고, 담체 세포는 이. 콜라이 세포이며, 여기서 항박테리아제는 (i) 표적 염색체 핵산 서열을 인식 및 변형시킬 수 있는 가이드된 뉴클레아제로서, 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 억제하도록 염색체를 변형시키는 것인, 가이드된 뉴클레아제를 포함하고, (ii) 표적 세포에 포함된 염색체 프로토스페이서 서열을 절단하도록 표적 세포에서 Cas 뉴클레아제와 함께 작동하는 CRISPR/Cas 시스템의 가이드 RNA 또는 crRNA를 코딩하고, 여기서 프로토스페이서 서열은 유전자 invB , sseE , 및 sicP 의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 조성물.
가축 동물에서 인수공통전염성 박테리아 표적 세포를 사멸시키는 비의학적 방법으로서, 방법은 동물에게 복수의 담체 세포를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 각 담체 세포는 표적 세포에 독성이 있지만 담체 세포에는 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하는 제1 에피솜 DNA를 포함하는 박테리아 세포이고, 담체 세포는 표적 세포에서의 항박테리아제의 발현을 위해 제1 에피솜 DNA의 표적 세포로의 접합 전달이 가능하며, 여기서 제1 에피솜 DNA는 표적 세포에서의 발현을 위해 담체 세포에서 표적 세포로 전달되어 항박테리아제를 생성함으로써 가축 동물에서 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 감소시키며, 여기서 표적 세포는 살모넬라 엔테리카 세포이고, 담체 세포는 이. 콜라이 세포이며, 여기서 항박테리아제는 (i) 표적 염색체 핵산 서열을 인식 및 변형시킬 수 있는 가이드된 뉴클레아제로서, 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 억제하도록 염색체를 변형시키는 것인, 가이드된 뉴클레아제를 포함하고, (ii) 표적 세포에 포함된 염색체 프로토스페이서 서열을 절단하도록 표적 세포에서 Cas 뉴클레아제와 함께 작동하는 CRISPR/Cas 시스템의 가이드 RNA 또는 crRNA를 코딩하고, 여기서 프로토스페이서 서열은 유전자 invB , sseE , 및 sicP 의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
제10항에 있어서, 방법이 가축 동물의 위장관에서 살모넬라를 감소시키는 것인 조성물.
제11항에 있어서, 방법이 가축 동물의 위장관에서 살모넬라를 감소시키는 것인 방법.
제10항 또는 제12항에 있어서, 방법이 동물의 그룹 (임의로 무리 또는 떼)에 대해 수행되며, 여기서 동물의 일부 또는 전부가 표적 세포를 포함하며, 여기서 표적 종의 표적 세포의 확산이 그룹에서 감소되거나; 또는 여기서 동물의 상기 그룹으로부터 제2 그룹으로의 확산이 감소되는 것인 조성물.
제11항 또는 제13항에 있어서, 방법이 동물의 그룹 (임의로 무리 또는 떼)에 대해 수행되며, 여기서 동물의 일부 또는 전부가 표적 세포를 포함하며, 여기서 표적 종의 표적 세포의 확산이 그룹에서 감소되거나; 또는 여기서 동물의 상기 그룹으로부터 제2 그룹으로의 확산이 감소되는 것인 방법.
제10항 또는 제12항에 있어서, 표적 세포가, 사멸되는 상이한 살모넬라 종 유형을 포함하는 것인 조성물.
제11항 또는 제13항에 있어서, 표적 세포가, 사멸되는 상이한 살모넬라 종 유형을 포함하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 담체 세포, 표적 세포 또는 DNA가 각각 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 담체 세포, 표적 세포 또는 DNA인 담체 세포.
제10항 또는 제12항에 있어서, 담체 세포, 표적 세포 또는 DNA가 각각 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 담체 세포, 표적 세포 또는 DNA인 조성물.
제11항 또는 제13항에 있어서, 담체 세포, 표적 세포 또는 DNA가 각각 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 담체 세포, 표적 세포 또는 DNA인 방법.

Description

항박테리아제 및 방법 본 발명은 박테리아 사이의 접합을 수행하기 위한 수단에 관한 것이고, 특히 본 발명은 항미생물제를 포함하는 담체 박테리아 및 사용 방법에 관한 것이다. 담체 박테리아는 표적 세포로의 작용제를 코딩하는 DNA의 접합 전달이 가능하다. 본 발명은 추가로 동물에서 성장 또는 사료 전환율 (FCR) 촉진에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 살모넬라(Salmonella)를 사멸시키거나 살모넬라의 성장 또는 증식을 억제하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 예컨대 식물의 성장, 건조 중량, 습윤 중량 또는 작물 생산을 촉진하는데 유용한 슈도모나스(Pseudomonas)를 사멸시키거나 슈도모나스의 성장 또는 증식을 억제하는 것에 관한 것이다. 염색체외 복제 (ori) 및 전달 (tra)을 제어하는 DNA 서열은 서로 별개이며; 즉, 복제 서열은 일반적으로 플라스미드 전달을 제어하지 않으며 그 반대도 또한 마찬가지이다. 복제 및 전달 둘 다는 플라스미드- 및 숙주-코딩된 기능 둘 다를 사용하는 복잡한 분자 프로세스이다. 박테리아 접합은 한 박테리아에서 또 다른 박테리아로의 유전 정보의 단방향 및 수평 전송이다. 전달된 유전 물질은 플라스미드일 수 있거나, 염색체의 일부일 수 있다. 접합성 플라스미드를 보유하는 박테리아 세포는 공여자 및 수용자 세포의 커플링, 및 유전 정보의 전달에 관여하는 표면 구조 (성선모)를 함유한다. 접합은 세포 사이의 접촉을 포함하며, 유전 형질의 전달은 많은 플라스미드에 의해 매개될 수 있다. 모든 자연적 전달 메커니즘 중에서, 접합이 가장 효율적이다. 예를 들어, 이. 콜라이의 F 플라스미드, 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis)의 pCFlO 플라스미드 및 바실루스 투린기엔시스 (Bacillus thuringiensis)의 pXO16 플라스미드는 교배 쌍의 확립을 위해 상이한 메커니즘을 사용하고, 교배 응집체의 크기가 상이하고, 그람-음성 (F) 뿐만 아니라 그람-양성 (pCFlO 및 pXO16) 박테리아 내에서 상이한 숙주 범위를 갖는다. 이들의 플라스미드 크기가 또한 상이하며; 각각 54, 100 및 200 kb이다. 그러나, 놀랍게도, 이러한 접합 시스템은 액체 배지에서 접합 전달을 지속시킬 수 있고, 종종 매우 짧은 시간에 100%에 가까운 전달 효율에 도달한다는 매우 중요한 공통 특징을 갖는다. 그러므로, 접합 프로세스는 환경 뉴클레아제에 대한 플라스미드 DNA의 보호, 및 수용자 세포로의 플라스미드 DNA의 매우 효율적인 전달을 허용한다. 접합 기능은 자연적으로 플라스미드 코딩된다. 하나의 종 내에 (좁은 숙주 범위) 또는 많은 종 사이에 (광범위한 숙주 범위) 연관 유전자를 전달할 수 있는 수많은 접합성 플라스미드 (및 트랜스포존)가 공지되어 있다. 전송가능한 플라스미드는 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 바실루스(Bacillus), 클로스트리디움(Clostridium) 및 노카르디아(Nocardia)의 병원성 균주를 포함하나 이에 제한되지는 않는 수많은 그람-양성 속에서 보고되었다. 접합의 초기 단계는 일반적으로 그람-음성 및 그람-양성 박테리아에서 상이하다. 그람-음성 박테리아로부터의 접합성 플라스미드에서 일부 전달 유전자의 역할은 선모-매개 세포-대-세포 접촉, 접합 기공의 형성 및 관련 형태학적 기능을 제공하는 것이다. 선모는 그람-양성 박테리아에서 접합을 개시하는데 관여하는 것으로 보이지 않는다. 본 발명은 하기를 제공한다: 대상체의 성장 또는 중량을 증진시키기 위한 방법 (예를 들어, 비의학적 또는 의학적)으로서, 여기서 대상체는 박테리아 표적 세포를 포함하고, 방법은 표적 세포에 독성이 있는 항박테리아제를 코딩하는 제1 에피솜 DNA를 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 제1 DNA는 표적 세포로 전달되고 작용제가 발현되어, 이에 의해 대상체에서 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 감소시키고 대상체의 성장 또는 중량을 증진시키는 것인 방법. 한 실시양태에서, 하기가 제공된다: 대상체의 성장 또는 중량을 증진시키기 위한 방법 (예를 들어, 비의학적 또는 의학적)으로서, 여기서 방법은 복수의 담체 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 대상체는 박테리아 표적 세포를 포함하고, 각 담체 세포는 표적 세포에 독성이 있지만 담체 세포에 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하는 제1 에피솜 DNA를 포함하는 박테리아 세포이고, 담체 세포는 그 내에서의 작용제의 발현을 위해 표적 세포로의 DNA의 접합 전달이 가능하며, 여기서 제1 DNA는 그 내에서의 발현을 위해 담체 세포로부터 표적 세포로 전달되어 항박테리아제를 생성하며, 이에 의해 대상체에서 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 감소시키고 대상체의 성장 또는 중량을 증진시키는 것인 방법. 유리하게는, 대상체에서 FCR이 개선 (즉, 증진)되며, 즉, FCR 수가 저하된다. 본 발명의 방법이 대상체의 그룹 (예를 들어, 동물, 예컨대 가축 동물의 그룹)에 대해 수행되는 경우, FCR이 그룹의 개체에서 저하되거나, 평균 FCR이 그룹에서 저하된다. 저하는 담체 세포(들)의 투여 전 FCR과의 비교로서 또는 동일한 종, 연령 그룹의 동물에 대한 평균 및 비교가능한 또는 동일한 식이를 공급할 때의 평균과 비교하여 평가될 수 있다. 통상의 기술자는 예컨대 가축 동물, 예를 들어 새끼 돼지, 돼지, 양, 소 (젖소 또는 육우), 어류, 조개류, 가금류 (예를 들어, 닭 (육용계 또는 알을 낳는 암탉), 거위, 오리 또는 칠면조)에 대한 표준 FCR에 친숙할 것이다. 본 발명은 또한 하기를 제공한다: 담체 세포로서, 여기서 세포는 박테리아 표적 세포에 독성이 있지만 담체 세포에 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하는 제1 에피솜 DNA를 포함하는 박테리아 세포이고, 담체 세포는 그 내에서의 항박테리아제의 발현을 위해 표적 세포로의 DNA의 접합 전달이 가능하며, 이에 의해 표적 세포를 사멸시키며, 여기서 표적 세포는 살모넬라 세포이고, 담체 세포는 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 세포인 담체 세포. 병원성 박테리아 표적 세포에 의한 감염을 치료하기 위해 대상체에게 세포를 투여하는 것을 포함하는 방법에서 사용하기 위한 복수의 담체 세포를 포함하는 조성물로서, 여기서 각 담체 세포는 표적 세포에 독성이 있지만 담체 세포에 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하는 제1 에피솜 DNA를 포함하는 박테리아 세포이고, 담체 세포는 그 내에서의 작용제의 발현을 위해 표적 세포로의 DNA의 접합 전달이 가능하며, 여기서 제1 DNA는 그 내에서의 발현을 위해 담체 세포로부터 표적 세포로 전달되어 항박테리아제를 생성하며, 이에 의해 대상체에서 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 감소시키며, 여기서 표적 세포는 살모넬라 세포이고, 담체 세포는 엔테로박테리아세아에 세포인 조성물. 동물 (임의로 가축 동물)에서 인수공통전염성 박테리아 표적 세포를 사멸시키는 비의학적 방법으로서, 방법은 동물에게 복수의 담체 세포를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 각 담체 세포는 표적 세포에 독성이 있지만 담체 세포에 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하는 제1 에피솜 DNA를 포함하는 박테리아 세포이고, 담체 세포는 그 내에서의 작용제의 발현을 위해 표적 세포로의 DNA의 접합 전달이 가능하며, 여기서 제1 DNA는 그 내에서의 발현을 위해 담체 세포로부터 표적 세포로 전달되어 항박테리아제를 생성하며, 이에 의해 대상체에서 표적 세포를 사멸시키거나 표적 세포의 성장 또는 증식을 감소시키며, 여기서 표적 세포는 살모넬라 세포이고, 임의로 담체 세포는 엔테로박테리아세아에 세포인 방법. DNA (임의로 본 발명의 방법에서 사용하기 위한)로서, 여기서 DNA는 표적 세포에 도입될 수 있으며, 여기서 DNA는 CRISPR/Cas 시스템의 복수의 가이드 RNA 또는 crRNA를 코딩하며, 여기서 가이드 RNA 또는 crRNA는 표적 세포 게놈에 의해 포함된 복수의 프로토스페이서 서열을 인식하도록 표적 세포에서 Cas 뉴클레아제와 함께 작동가능하며; 여기서 (a) 프로토스페이서 서열은 표적 세포 게놈의 하나 이상의 병원성 섬 뉴클레오티드 서열을 포함하고/거나; (b) 프로토스페이서 서열은 표적 세포 게놈의 하나 이상의 침입 유전자 서열을 포함하고/거나; (c) 프로토스페이서 서열은 표적 세포 게놈의 하나 이상의 분비 시스템 유전자 서열을 포함하고/거나; (d) 프로토스페이서 서열은 살모넬라의 avrA, sptP, sicP, sipA, sipD, sipC, sipB, sicA, invB, ssaE, sseA, sseB, sscA, sseC, sseD, sseE, sscB, sseF, sseG, mgtC, cigR, pipA, pipB, pipC, sopB 및 pipD (임의로 invB, sicP, sseE, pipA, pipB, pipC, hilA, marT 및 sopB로부터 선택됨), 및 그의 오르토로그 또는 상동체로부터 선택된 A 유전자로부터 선택된 유전자의 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 DNA. 또한 본 발명은 하기 구성을 제공한다:- 제1 구성에서 제1 에피솜 DNA를 포함하는 담체 박테리아 세포로서, DNA는 관심 핵산 서열 (NSI)을 코딩하거나 표적 박테리아 세포에 독성이 있지만 담체 세포에 독성이 없는 항박테리아제를 코딩하고, 담체 세포는 그 내에서의 작용제의 발현을 위해 표적 세포로의 DNA의 접합 전달이 가능하며, 임의로 여기서 (a) 담체 세포는 제1 DNA와 상이한 제2 DNA를 포함하며, 여기서 제2 DNA는 제1 DNA의 복제에 필요한 제1 인자를 포함하거나 코딩하고; (b) 제1 DNA는 상기 제1 인자를 포함하거나 코딩하지 않으며, 여기서 제1 DNA는 제1 인자의 부재 하에 자기-복제적이지 않지만, 제2 DNA에 의해 제공된 제1 인자의 존재 하에 담체 세포에서 복제할 수 있고; (c) 여기서 세포는 표적 박테리아 세포로의 제1 DNA의 접합 전달을 수행하기에 충분한 하나 이상의 접합 인자를 코