Search

KR-102960868-B1 - Method for producing plants with enhanced environmental stress tolerance through YCF1 gene overexpression

KR102960868B1KR 102960868 B1KR102960868 B1KR 102960868B1KR-102960868-B1

Abstract

본 발명은 YCF1 유전자 과발현을 통한 환경 스트레스 내성이 증대된 식물체의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는 효모 카드뮴 인자 1(YCF1, Yeast cadmium factor 1)을 아라비돕시스 탈리아나( Arabidopsis thaliana )에 이종 발현시켜 비생물적 스트레스, 특히 Cd 및 산화 스트레스에 대한 내성을 증대시킨 식물체를 제조하는 방법에 관한 것이다. YCF1 과발현 형질전환체 중 난쟁이 표현형(YCF1_Dw)은 ROS 소거 효소인 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(SOD), 카탈라아제(CAT), 아스코르브산 퍼옥시다아제(APX) 등의 발현을 증가시켜 ROS 축적을 더욱 효과적으로 억제한다. 또한, 본 발명의 YCF1 과발현 형질전환체 중 난쟁이 표현형(YCF1_Dw)은 크기가 작아 관리가 용이하고, 식물복원과 같은 환경 생명공학 응용에 실용적인 이점을 제공한다. 따라서 본 발명은 환경 스트레스 내성 증대 및 식물 복원 기술의 발전에 기여할 수 있는 중요한 잠재력을 가질 수 있다.

Inventors

  • 이준우
  • 설민아
  • 이은선
  • 남경희
  • 전성준
  • 김선숙

Assignees

  • 국립생태원

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20241203

Claims (5)

  1. (a) 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 YCF1 유전자를 과발현시킬 수 있는 조절 서열에 작동 가능하게 연결되도록 발현벡터에 삽입시키는 단계; (b) 상기 발현벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계; (c) 대조군 대비 성장이 지연된 왜소형 표현형을 갖는 식물체를 선별하는 단계;를 포함하는 왜소형 표현형을 갖는 식물체의 제조방법에서, 상기 왜소형 표현형은 뿌리의 길이는 대조군과 유사하고, 잎은 대조군 대비 바깥쪽으로 말리는 형태와 성장이 지연된 것이며, 생중량은 대조군 대비 감소된 것이고, 상기 왜소형 표현형을 갖는 식물체는 산화 스트레스 조건 하에서 ROS 소거 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 왜소형 표현형을 갖는 식물체의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항의 제조방법으로 제조된 왜소형 표현형을 갖는 식물체에서, 상기 왜소형 표현형을 갖는 식물체는 산화 스트레스 내성을 가지는 것을 특징으로 하는, 식물체.
  5. 삭제

Description

YCF1 유전자 과발현을 통한 환경 스트레스 내성이 증대된 식물체의 제조방법{Method for producing plants with enhanced environmental stress tolerance through YCF1 gene overexpression} 본 발명은 YCF1(Yeast cadmium factor 1) 유전자 과발현을 통한 환경 스트레스 내성이 증대된 식물체의 제조방법에 관한 것이다. 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)의 효모 카드뮴 인자 1(YCF1)은 Cd, As, Sb를 포함한 중금속을 해독하는 효소로 알려져 있다. 이전 연구에서는 고등 식물에서 YCF1 이종 발현을 통해 중금속을 해독하는 것에 대해 연구를 하였다. 해당 연구에서는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana; A. thaliana)에서 YCF1 과발현은 Pb 및 Cd 내성을 향상시키고 축적을 증가시켰다. 마찬가지로, 브라시카 준세아(Brassica juncea)에서 YCF1 과발현은 Cd 및 Pb 스트레스에 대한 내성을 향상시켰다. 한편, 식물 방어에 관여하는 다양한 신호 전달 경로는 중금속과 같은 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 조절한다. 이 중 비생물적 스트레스로 인해 축적된 반응성 활성산소종(ROS, reactive oxygen species)을 효과적으로 제거하는 것은 스트레스 저항성을 높이는 메커니즘 중 하나이다. 식물 세포가 환경적 또는 비생물적 스트레스에 노출되면 ROS가 축적되어 외부 자극에 대한 세포 반응을 유발한다. 이러한 과도한 ROS는 세포 독성, 노화 및 세포 사멸을 일으킬 수 있다. 식물은 카탈라아제(CAT, catalase), 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(SOD, superoxide dismutase), 글루타티온 퍼옥시다아제(GPX, glutathione peroxidase), 아스코르브산 퍼옥시다아제(APX, ascorbate peroxidase)와 같은 항산화 효소를 활성화하여 ROS 축적을 줄임으로써 ROS 항상성을 유지한다. 식물은 스트레스에 반응하여 항산화 유전자의 발현을 조절하여 ROS 수준을 조절하는 다양한 전사 인자를 포함하는 복잡한 신호 전달 네트워크를 진화시켰다. 그중에서도 WRKY 패밀리는 중요한 역할을 한다. WRKY 패밀리 구성원은 프로모터에서 W-box를 인식하고 표적 유전자의 발현을 유도하여 세포 항상성을 달성하는 비생물적 스트레스 반응에 관여하는 전사 인자로 구성됩니다. 아라비돕시스 탈리아나에서 WRKY13 과발현은 Cd 축적을 감소시키고 Cd 내성을 강화한다. WRKY25는 세포 내 산화환원 조절과 산화 스트레스에 대한 저항력 강화에 관여한다. WRKY25 과발현은 아라비돕시스 탈리아나에서 H2O2 소거 능력을 증가시켜 노화를 증가시키지 않고 수명을 늘린다. 본 발명은 아라비돕시스 탈리아나에서 비생물적 스트레스 조건에서 YCF1 이종 발현과 스트레스 저항성 간의 상관 관계를 고려하여 ROS 조절 메커니즘을 밝히는 것을 목표로 하였다. YCF1 이종 발현은 아그로박테리움(Agrobacterium) 매개 형질 전환을 통해 달성되었다. 분자 및 생리학적 분석을 수행하여 YCF1 유전자가 ROS 소거 및 전사 인자 조절에 미치는 영향을 조사하였고, YCF1 이종 발현은 중금속 및 산화 스트레스 조건에서 ROS 소거 유전자를 활성화하여 ROS 항상성을 유지하는 것을 확인하였다. 또한, WRKY 패밀리 구성원의 발현 패턴을 분석하여 특히 YCF1 이종 발현을 고려하여 스트레스 내성에서의 역할을 평가하였다. 도 1은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 효모 카드뮴 인자 1(YCF1) 발현 구조와 형질전환체에서의 YCF1 상대 발현의 개략도를 나타낸 도이다. (A)는 아라비돕시스 탈리아나에서 YCF1 과발현에 사용된 pCAMBIA1302 벡터의 개략도를 나타냄. (B)는 형질전환체에서의 YCF1 상대 발현 수준을 나타냄. YCF1_Wt와 YCF1_Dw 간의 유의한 차이는 Holm-Sidak 방법(**P < 0.01)에 따라 별표로 표시하였음. 오차 막대는 평균의 표준 편차를 나타냄. YCF1_Wt은 야생형 표현형을 보이며, YCF1_Dw는 난쟁이 표현형을 보임 도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 아라비돕시스 탈리아나에서 산화 스트레스 하에 있는 효모 카드뮴 인자 1(YCF1) 과발현이 뿌리 길이와 생체 중량에 미치는 영향(A-C) 산화 스트레스를 유도하기 위해 다양한 H2O2 농도를 함유한 무라시게와 스쿠그 배지(Murashige and Skoog medium)에서 Col-0, YCF1_Wt, YCF1_Dw 묘목의 성장 비교를 나타낸 도이다(척도 막대 = 1cm). (D)는 뿌리 길이의 정량적 분석이며, (E)는 Col-0, YCF1_Wt, YCF1_Dw에서 생체 중량 측정을 나타낸 도이다. YCF1_Wt는 야생형 표현형을 나타내고 YCF1_Dw는 왜성 표현형을 나타냄. 다른 글자는 생물학적 삼중 반복에 대한 Tukey의 HSD 검정을 사용한 ono-way ANOVA에 의해 유의미한 차이(p < 0.05)를 나타냄 도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 스트레스 조건에서 형질전환체에서 효모 카드뮴 인자 1(YCF1) 발현의 비교 분석으로 50 및 100 μM Cd에서 형질전환체의 상대적 YCF1 발현 수준(A)을 나타낸 것이고, 0.5 및 1 mM H2O2 처리에서 형질전환체의 상대적 YCF1 발현 수준(B)를 나타낸 도이다. 오차 막대는 평균의 표준 편차를 나타내며, YCF1_Wt는 야생형 표현형을 나타내고 YCF1_Dw는 왜소한 표현형을 나타냄 도 4는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 스트레스에 대한 아라비돕시스 탈리아나의 전사인자 발현 수준을 나타낸 도이다. (A)는 50 μM Cd 처리 시 WRKY13 및 WRKY25 상대 유전자 발현을 나타내고, (B)는 0.5 mM H2O2 처리 시 WRKY13 및 WRKY25 상대 유전자 발현을 나타냄. Col-0 및 YCF1 형질전환체 간의 유의한 차이는 Holm-Sidak 방법에 따라 별표로 표시하였으며(**P < 0.01에서 통계적 유의성을 나타냄), 오차 막대는 평균의 표준 편차를 나타냄 도 5는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 스트레스 조건에서 반응성 활성산소종(ROS) 소거 효소의 발현을 나타낸 도이다. (A)는 50 μM Cd 처리 시 CAT, SOD1, APX1 및 GST2의 상대적 발현 수준을 나타낸 것이고, (B)는 0.5 mM H2O2 처리 시 동일한 ROS 소거 효소의 상대적 발현 수준을 나타낸 것임. Col-0과 YCF1 형질전환체 간의 유의한 차이는 Holm-Sidak 방법을 기반으로 별표로 표시하였으며(* 및 **는 각각 P < 0.05 및 P < 0.01에서 통계적 유의성을 나타냄), 오차 막대는 평균의 표준 편차를 나타냄 이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(Terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다. 본 발명의 아라비돕시스 탈리아나에서 이종 발현되는 효모 카드뮴 인자 1(YCF1)은 반응성 활성산소종(ROS) 소거와 핵심 전사 인자인 WRKY13 및 WRKY25의 조절을 통해 비생물적 스트레스, 특히 Cd 및 산화 스트레스에 대한 내성을 향상시킨다. 본 발명에서 YCF1을 발현하는 아라비돕시스 형질전환체는 아그로박테리움 매개 형질전환을 통해 생성되었으며, 그 결과 두 가지 뚜렷한 표현형이 나타났다. 야생형과 유사한 모습을 보이는 YCF1_Wt와 YCF1_Wt보다 높은 YCF1 발현 수준을 보이는 난쟁이 키를 보이는 YCF1_Dw이다. 본 발명에서 비교 분석 결과, 난쟁이 키를 보이는 YCF1_Dw는 항산화 효소인 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(SOD1), 카탈라아제(CAT), 아스코르브산 과산화효소1(APX1)의 발현이 증가하여 스트레스 내성이 개선됨을 나타내는 ROS 소거 활성이 상당히 향상된 것으로 나타났다. 또한 본 발명에서는 여러 스트레스 조건에서 WRKY13과 WRKY25의 발현 차이가 나타났으며, WRKY13과 WRKY25는 각각 Cd와 산화 스트레스에 반응하여 상향 조절되어 YCF1에 의해 촉진되는 스트레스 특이적 조절 메커니즘을 시사하였다. 게다가 YCF1_Dw 표현형은 크기가 작아서 통제된 환경에서 관리하기 쉽기 때문에 식물복원에 적용하는 데 실용적인 이점을 제공할 수 있음을 확인하였다. 이러한 발견은 YCF1이 식물 스트레스 내성을 향상시키는 잠재력을 강조하며 농업 및 환경 생명공학에 중요한 의미를 갖는 것이다. 이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 자세히 설명한다. 다만, 상기 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주