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KR-102960935-B1 - 항 PD-L1 및 PD-L2 항체 및 이의 유도체 및 용도

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Abstract

PD-L1 나노바디, PD-L2 나노바디 및 PD-L1 나노바디 및 PD-L2 나노바디를 동시에 갖는 이중 특이적 항체를 제공하고, 상기 이중 특이적 항체는 PD-1/PD-L1 및 PD-1/PD-L2 경로를 동시에 차단할 수 있다. 본 발명의 이중 특이적 항체는 T 세포의 활성을 회복시키고 면역 반응을 증강시키며, 종양 발생 및 발달에 대한 억제 효과를 보다 효과적으로 향상시킬 수 있다.

Inventors

  • 미아오, 시아오니우
  • 우, 판
  • 첸, 쳉

Assignees

  • 바이오세우스 인크.

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20210330
Priority Date
20200331

Claims (15)

  1. 항 PD-L2 나노바디로서, 상기 PD-L2 나노바디의 VHH 사슬의 상보성 결정 영역(CDR)은, 서열번호 57로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 CDR1; 서열번호 58로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및 서열번호 59로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 CDR3; 또는 서열번호 60으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 CDR1; 서열번호 61로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및 서열번호 62로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 CDR3으로 구성되는 것을 특징으로 하는 항 PD-L2 나노바디.
  2. 항 PD-L1 나노바디로서, 상기 PD-L1 나노바디의 VHH 사슬의 상보성 결정 영역(CDR)은, 서열번호 63으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 CDR1; 서열번호 64로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 CDR2; 및 서열번호 65로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 CDR3으로 구성되는 것을 특징으로 하는 항 PD-L1 나노바디.
  3. 제1항에 있어서, 항 PD-L2 나노바디의 VHH 사슬의 아미노산 서열은 서열번호 3, 16, 17 또는 18로 표시되거나; 또는 항 PD-L2 나노바디의 VHH 사슬의 아미노산 서열은 서열번호 12 또는 15로 표시되는 것을 특징으로 하는 항 PD-L2 나노바디.
  4. 제2항에 있어서, 항 PD-L1 나노바디의 VHH 사슬의 아미노산 서열은 서열번호 19 또는 22로 표시되는 것을 특징으로 하는 항 PD-L1 나노바디.
  5. 이중 특이적 항체로서, 상기 이중 특이적 항체는 제2항에 따른 항 PD-L1 나노바디 및 제1항에 따른 항 PD-L2 나노바디를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중 특이적 항체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 이중 특이적 항체는 식 I 또는 식 II로 표시되는 구조의 폴리펩티드를 포함하되, A-L1-Fc1-L2-B (식 I) A-L3-B-L4-Fc1 (식 II) A 및 B는 각각 독립적으로 제2항에 따른 항 PD-L1 나노바디 또는 제1항에 따른 항 PD-L2 나노바디이고, A 및 B는 상이한 항체이며; L1, L2, L3 및 L4는 각각 독립적으로 펩티드 결합 또는 링커 요소이고; Fc1은 항체의 Fc 세그먼트이되; Fc1은 인간 IgG 도메인이며; “-”는 펩티드 결합인 것을 특징으로 하는 이중 특이적 항체.
  7. 분리된 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 제1항에 따른 항 PD-L2 나노바디, 제2항에 따른 항 PD-L1 나노바디, 또는 제5항에 따른 이중 특이적 항체를 코딩하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  8. 벡터로서, 상기 벡터는 제7항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  9. 단리된 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 제8항에 따른 벡터를 포함하거나, 또는 이의 게놈에는 제7항에 따른 폴리뉴클레오티드가 통합되어 있거나; 또는, 상기 숙주 세포는 제1항에 따른 항 PD-L2 나노바디, 제2항에 따른 항 PD-L1 나노바디, 또는 제5항에 따른 이중 특이적 항체를 발현하는 것을 특징으로 하는 단리된 숙주 세포.
  10. 이중 특이적 항체의 생산 방법으로서, (a) 적합한 조건하에, 제9항에 따른 숙주 세포를 배양하여, 이중 특이적 항체를 포함하는 배양물을 얻는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 얻은 배양물을 정제 또는 분리하여, 이중 특이적 항체를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중 특이적 항체의 생산 방법.
  11. 면역 접합체로서, 상기 면역 접합체는, (a) 제1항에 따른 항 PD-L2 나노바디, 제2항에 따른 항 PD-L1 나노바디, 또는 제5항에 따른 이중 특이적 항체; 및 (b) 검출 가능한 표지, 약물, 독소, 사이토카인, 방사성 핵종, 효소, 금 나노입자/나노로드, 자성 나노입자, 바이러스 외피 단백질 또는 VLP, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 접합 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 접합체.
  12. 제1항에 따른 항 PD-L2 나노바디, 제2항에 따른 항 PD-L1 나노바디, 제5항에 따른 이중 특이적 항체, 또는 제11항에 따른 면역 접합체를 포함하는, PD-L1 또는 PD-L2의 검출용 조성물.
  13. (i) 제1항에 따른 항 PD-L2 나노바디, 제2항에 따른 항 PD-L1 나노바디, 제5항에 따른 이중 특이적 항체, 또는 제11항에 따른 면역 접합체; 및 (ii) 약학적으로 허용 가능한 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는, PD-L1을 발현하는 종양 또는 PD-L2를 발현하는 종양의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제11항에 따른 면역 접합체 및 검출학적으로 허용 가능한 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 PD-L1 또는 PD-L2 검출용 조성물.
  15. 제12항의 검출용 조성물을 포함하는, PD-L1 또는 PD-L2의 검출용 키트 또는 검출 플레이트.

Description

항 PD-L1 및 PD-L2 항체 및 이의 유도체 및 용도 본 발명은 생물의학 또는 생물제약 기술분야에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 항 PD-L1 및 PD-L2 항체 및 이의 유도체 및 용도에 관한 것이다. CD279라고도 하는 프로그램된 사멸 인자 1(programmed death-1, PD-1)은 CD28 패밀리 구성원으로, 세포질 영역에는 2개의 티로신 잔기가 포함되고, N 말단에 근접한 하나는 면역 수용체 티로신 기반 억제 모티프(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM)에 위치하며, C 말단에 근접한 하나는 면역 수용체 티로신 기반 전환 모티프(immunoreceptor tyrosine-based switch motif, ITSM)에 위치한다. PD-1은 주로 활성화된 T 림프구, B 림프구 및 대식 세포의 표면에서 발현된다. 정상적인 경우, PD-1은 T 림프구의 기능을 억제하고 Treg의 기능을 촉진하여, 자가 면역 반응을 억제하고 자가 면역 질환의 발생을 방지할 수 있다. CD274라고도 하는 프로그램된 사멸 인자 1 리간드 1(programmed death 1 ligand 1, PD-L1)은 B7 패밀리 구성원으로, PD-1의 리간드이다. PD-L1은 하나의 IgV 유사 도메인, 하나의 IgC 유사 도메인, 하나의 막횡단 소수성 도메인 및 30개의 아미노산으로 구성된 하나의 세포내 도메인을 포함하여 총 290개의 아미노산을 갖는 I형 막횡단 단백질에 속한다. 다른 B7 패밀리 분자와 달리, PD-L1은 면역 반응의 음성 조절 작용을 갖는다. 연구에 따르면, PD-L1은 주로 활성화된 T 세포, B 세포, 대식 세포 및 수지상 세포 등에서 발현되고, 림프구 외에 PD-L1은 또한 흉선, 심장, 태반과 같은 다양한 조직의 내피 세포, 및 흑색종, 간암, 위암, 신세포암, 난소암, 결장암, 유방암, 식도암, 두경부암과 같은 다양한 비림프계에서도 발현된다. PD-L1은 자가 반응성 T, B 세포 및 면역 관용을 조절하는 측면에서 일정한 보편성을 갖고, 말초 조직 T 및 B 세포 반응에 작용을 일으킨다. 종양 세포에서 PD-L1의 고발현은 암 환자의 나쁜 예후와 관련이 있다. 그러나, 종양 발생시 종양 세포에서 발현된 PD-L1과 PD-1의 결합은 림프구에 대한 억제 작용을 통해 종양의 면역 회피를 촉진할 수 있다. PD-L1과 PD-1의 결합은 다양한 생물학적 변화를 일으켜, 면역 조절을 유도할 수 있는 바, 예를 들어 림프구의 증식 및 활성화를 억제하고, CD4+ T 세포가 Th1 및 Th17 세포로 분화하는 것을 억제하며, 염증성 사이토카인의 방출 등을 억제할 수 있다. CD273 또는 B7-DC라고도 하는 프로그램된 사멸 인자 1 리간드 2(programmed death 1 ligand 2, PD-L2)는 PD-1의 다른 중요한 리간드이다. PD-1과 PD-L2의 상호작용은 CD4+ T 세포의 활성화 및 증식을 억제하고, 사이토카인의 방출을 감소시키며, 종양의 면역 회피를 증가시킬 수 있다. PD-1과 PD-L1 및 PD-L2의 상호작용을 동시에 차단하면 PD-1 경로 활성화에 의한 면역 시스템의 억제를 효과적으로 해방하고, 유기체의 자가 면역 시스템을 활성화하며, 종양을 사멸할 수 있다. 그러나, 시중에는 현재까지 PD-L1/PD-L2를 동시에 표적화하는 이중 특이적 단일 도메인 항체가 공개되지 않았고, 단일 도메인 항체는 차세대 항체 진단 및 치료의 신흥 강자로서 안정성이 높고 수용성이 우수하며 인간화가 간단하고 표적성이 높으며 침투성이 높고, 면역 실험, 진단 및 치료에서 상상을 초월하는 큰 기능을 발휘한다. 따라서, 본 기술분야는 PD-L1 및 PD-L2를 동시에 표적화할 수 있는 이중 특이적 단일 도메인 항체가 시급한 실정이다. 도 1은 정제된 항 PD-L2 항체와 CHO-hPD-L2 세포의 결합 활성을 나타낸다. 도 2는 PD-L2와 PD-1의 결합에 대한 정제된 항 PD-L2 항체의 차단 효과를 나타낸다. 도 3은 D-Na-96 인간화 항체와 CHO-hPD-L2 세포의 결합 활성을 나타낸다. 도 4는 PD-L2와 PD-1의 결합에 대한 D-Na-96 인간화 항체의 차단 효과를 나타낸다. 도 5는 인간화 항 PD-L1 나노바디와 CHO-hPD-L1 세포의 결합 활성을 나타낸다. 도 6은 3가지 상이한 형태의 항 PD-L1/PD-L2 이중 특이적 항체의 구조 모식도를 나타낸다. 도 7은 본 발명의 항 PD-L1/PD-L2 이중 특이적 항체와 CHO-hPD-L1 세포(도 7a) 또는 CHO-hPD-L2 세포(도 7b)의 결합 활성을 나타낸다. 도 8은 PD-L1과 PD-1의 결합(도 8a) 및 PD-L2와 PD-1의 결합(도 8b)에 대한 본 발명의 항 PD-L1/PD-L2 이중 특이적 항체의 차단 효과를 나타낸다. 도 9는 PDL1/PDL2/PD1/luc 신호 전달 경로에 대한 항 PD-L1/PD-L2 이중 특이적 항체의 차단 효과를 나타낸다. 본 발명자의 광범위하고 심층적인 연구 끝에, 대량의 스크리닝을 통해 항 PD-L1 단일 도메인 항체 및 항 PD-L2 단일 도메인 항체를 포함하는 항 PD-L1/PD-L2 이중 특이적 항체를 처음으로 예기치 않게 발견하였다. 실험에 따르면, 본 발명의 이중 특이적 항체는 PD-L1 및 PD-L2 분자에 대해 모두 우수한 결합 활성을 갖고, PD-1과 PD-L1의 상호작용 및 PD-1과 PD-L2의 상호작용을 동시에 차단할 수 있으며, 체외에서 PD-L1/PD-1 및 PD-L2/PD-1 신호 전달 경로를 동시에 차단하고 다운스트림 리포터 유전자의 발현을 활성화할 수 있어, 우수한 항종양 활성을 갖는다. 이의 기초상에서 본 발명을 완료하였다. 용어 본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 먼저 특정 용어를 정의한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 본문에 달리 명시적으로 언급되지 않는 한 하기 용어 중 각각은 아래에 주어진 의미를 갖는다. 다른 정의는 본 발명 전체에 설명되어 있다. 이중 특이적 항체 본문에 사용된 바와 같이, 용어 “본 발명의 이중 특이적 항체”, “본 발명의 디아바디”, “항 PD-L1/PD-L2 이중 특이적 항체”는 동일한 의미를 갖고, PD-L1 및 PD-L2를 특이적으로 인식하고 결합하는 이중 특이적 항체를 의미한다. 본 발명은 항 PD-L1 단일 도메인 항체 및 항 PD-L2 단일 도메인 항체를 포함하는 항 PD-L1/PD-L2 이중 특이적 항체를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 이중 특이적 항체는 식 I 또는 식 II로 표시되는 구조의 폴리펩티드, 또는 식 III 및 식 IV로 표시되는 구조의 폴리펩티드를 동시에 포함하되, A-L1-Fc1-L2-B (식 I) A-L3-B-L4-Fc1 (식 II) A-L5-Fc2-L6-Fc1 (식 III) B-L7-Fc2 (식 IV) A 및 B는 각각 독립적으로 항 PD-L1 단일 도메인 항체 또는 항 PD-L2 단일 도메인 항체이고, A 및 B는 상이한 항체이며; L1, L2, L3 및 L4는 각각 독립적으로 펩티드 결합 또는 링커 요소이고; Fc1, Fc2는 모두 항체의 Fc 세그먼트이되; Fc1은 인간 IgG 도메인(바람직하게는, LALA 돌연변이형 IgG 도메인)이고, Fc2는 CH1+CL 도메인이며; “-”는 펩티드 결합이다. 일 실시형태에서, 상기 이중 특이적 항체는 식 I로 표시되는 구조의 폴리펩티드를 갖고, 상기 폴리펩티드는 Fc1 사이의 이황화 결합 작용을 통해 동종이량체 i를 형성한다. 일 실시형태에서, 상기 이중 특이적 항체는 식 II로 표시되는 구조의 폴리펩티드를 갖고, 상기 폴리펩티드는 Fc1 사이의 이황화 결합 작용을 통해 동종이량체 ii를 형성한다. 일 실시형태에서, 상기 이중 특이적 항체는 식 III 및 식 IV로 표시되는 구조의 폴리펩티드 서열을 갖고, 상기 식 III로 표시되는 구조의 폴리펩티드와 식 IV로 표시되는 구조의 폴리펩티드 사이는 Fc2 사이의 이황화 결합 작용을 통해 이종이량체 a를 형성하고, 상기 이종이량체 ii는 Fc1 사이의 이황화 결합 작용을 통해 동종이량체 iii를 형성한다. 본문에 사용된 바와 같이, 용어 “단일 도메인 항체”, “나노바디 VHH”, “나노바디”는 동일한 의미를 갖고, 항체 중쇄의 가변 영역을 클로닝하여 하나의 중쇄 가변 영역으로만 구성된 나노바디(VHH)를 구축하는 것을 의미하고, 이는 완전한 기능을 갖는 최소 항원 결합 단편이다. 통상적으로, 먼저 천연적으로 경쇄 및 중쇄 불변 영역 1(CH1)이 결실된 항체를 획득한 후, 항체 중쇄의 가변 영역을 클로닝하여, 하나의 중쇄 가변 영역으로만 구성된 나노바디(VHH)를 구축한다. 본문에 사용된 바와 같이, 용어 “가변”은 항체 중 가변 영역의 일부 부분이 서열 상에서 상이함을 나타내고, 이는 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 결합과 특이성을 형성한다. 그러나, 가변성은 항체 가변 영역 전체에 고르게 분포되지 않는다. 이는 경쇄와 중쇄 가변 영역에서 상보성 결정 영역(CDR) 또는 초가변 영역이라고 하는 3개의 단편에 집중되어 있다. 가변 영역에서 더 보존된 부분을 프레임워크 영역(FR)이라고 한다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 4개의 FR 영역을 포함하며, 이들은 대략 β-시트 구성이고, 연결 고리를 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결되며, 일부 경우에서는 부분적으로 β-시트 구조를 형성할 수 있다. 각 사슬 중의 CDR은 FR 영역을 통해 밀착되고 다른 사슬의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위를 형성한다(Kabat 등, NIH Publ. No. 91-3242, 볼륨 I, 647-669페이지(1991) 참조). 불변 영역은 항원과 항원의 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 상이한 이펙터 기능을 나타내고, 예를 들어 항체의 항체 의존적 세포 독성에 관여하는 것이다. 본문에 사용된 바와 같이, 용어 “프레임워크 영역”(FR)은 CDR 사이에 삽입된 아미노산 서열, 즉 단일 종의 상이한 면역글로불린 사이에서 상대적으로 보존된 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 부분을 의미한다. 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄는 각각 4개의 FR을