KR-102960980-B1 - 에피머라제 및 벤질아이소퀴놀린 알칼로이드를 제조하는 방법

Abstract

( R )-1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드로 ( S )-1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드를 에피머화하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 ( S )-1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드를 적어도 하나의 효소와 접촉시키는 단계를 포함한다. ( S )-1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드를 적어도 하나의 효소와 접촉시키는 단계는 ( R )-1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드로 ( S )-1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드를 전환시킨다.

Inventors

• 스몰크, 크리스티나 디.
• 갈라니에, 스테파니
• 트렌차드, 이시스
• 토데이, 캐서린
• 리, 얀란

Assignees

• 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티

Dates

Publication Date

20260506

Application Date

20160509

Priority Date

20150508

Claims (20)

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16. 형질전환된 효모 세포 내에서 (S)-레티큘린을 (R)-레티큘린으로 에피머화하는 방법으로서, 형질전환된 효모 세포 내에서, (S)-레티큘린을 적어도 하나의 효소와 접촉시키는 단계를 포함하되, (S)-레티큘린을 적어도 하나의 효소와 접촉시키는 것은 (S)-레티큘린을 (R)-레티큘린으로 전환하고, (S)-레티큘린은 상기 효모 세포 내에서 생성되며, 상기 효소는 산화효소 도메인 및 환원효소 도메인을 포함하는 에피머라제를 포함하고, 상기 산화효소 도메인은 사이토크롬 P450 산화효소-유사 도메인이고, 상기 환원효소 도메인은 코데이논 환원효소-유사 도메인이며, 상기 효소는 서열 번호 9 및 10로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 에피머라제인, 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 적어도 하나의 효소는 상기 적어도 하나의 효소를 코딩하기 위한 코딩 서열을 가지는 조작된 비식물 세포를 배양함으로써 생성된, 방법.
18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 적어도 하나의 효소는 조작된 비식물 세포의 게놈 내의 유전자로부터 발현되는, 방법.
19. 제16항에 있어서, 세포 배양물로부터 (R)-레티 큘린 또는 이의 유도체를 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
20. 삭제

Description

에피머라제 및 벤질아이소퀴놀린 알칼로이드를 제조하는 방법 상호 참조 35 U.S.C. § 119(e)에 따라, 본원은 2015년 5월 8일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/159,122호 및 2015년 6월 11일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/174,475호(이들 출원의 개시내용은 본 명세서에서 참고로 포함됨)의 출원일에 대한 우선권을 주장한다. 게다가, 본원은 현재 US 제2014-0273109호로 공개된 미국 특허 출원 제14/211,611호(이 출원은 2014년 3월 14일에 출원되고, 변호사 문서 번호 STAN-1018을 가짐); 현재 WO 제2014/143744호로 공개된 PCT 출원 제PCT/US2014/027833호(이 출원은 2014년 3월 14일에 출원되고, 변호사 문서 번호 STAN-1018WO를 가짐); 미국 특허 출원 제15/031,618호(이 출원은 2016년 4월 22일에 출원되고, 변호사 문서 번호 STAN-1078을 가짐); 현재 WO 제2015/066642호로 공개된 출원 제PCT/US2014/063738(이 출원은 2014년 11월 3일에 출원되고, 변호사 문서 번호 STAN-1078WO를 가짐); 미국 가특허 출원 제62/080,610호(이 출원은 2014년 11월 17일에 출원되고, 변호사 문서 번호 STAN-1169PRV를 가짐); 미국 가특허 출원 제62/107,238호(이 출원은 2015년 1월 23일에 출원되고, 변호사 문서 번호 STAN-1169PRV2를 가짐); 출원 제PCT/US2015/060891호(이 출원은 2015년 11월 16일에 출원되고, 변호사 문서 번호 STAN-1169WO를 가짐); 미국 가특허 출원 제62/156,701호(이 출원은 2015년 5월 4일에 출원되고, 변호사 문서 번호 STAN-1221PRV를 가짐); 및 출원 제PCT/US2016/030808호(이 출원은 2016년 5월 4일에 출원되고, 변호사 문서 번호 STAN-1221WO를 가짐)(이들 출원의 개시내용은 본 명세서에서 참고로 포함됨)에 관한 것이다. 정부 지원된 조사에 대한 성명 본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)이 허여한 계약 AT007886 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 소정의 권한을 가진다. 본 개시내용은 조작된 숙주 세포에서 다양한 벤질아이소퀴놀린 알칼로이드(benzylisoquinoline alkaloid: BIA)를 제조하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 조작된 숙주 세포에서 생성된 다양한 알칼로이드의 조성물을 추가로 제공한다. 게다가, 본 개시내용은 조작된 숙주 세포에서 에피머라제를 제조하는 방법을 제공한다. 특정한 경우에, 본 개시내용은 조작된 숙주 세포에서 (R)-1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드로의 (S)-1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드의 에피머화를 통해 다양한 알칼로이드 생성물을 제조하는 방법을 제공한다. 추가의 특정한 경우에, 본 개시내용은 (R)-레티큘린으로의 (S)-레티큘린의 에피머화를 통해 다양한 알칼로이드 생성물을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 양태는 비조작된 세포에 비해 증가한 타이로신 하이드록실라제 활성을 가지는 조작된 비식물 세포를 제공한다. 본 발명의 또 다른 양태는 야생형 TyrH를 발현하는 세포에 비해 증가한 타이로신 하이드록실라제 활성을 가지는 조작된 비식물 세포를 제공한다. 본 발명의 추가적인 양태는 본 명세서에 제공된 바와 같은 타이로신 하이드록실라제 활성을 증가시키는 돌연변이가 없는 야생형 TyrH를 발현하는 세포에 비해 증가한 타이로신 하이드록실라제 활성을 가지는 조작된 비식물 세포를 제공한다. 특히, 조작된 비식물 세포는 기질 저해 경감 돌연변이; 생성물 저해 경감 돌연변이; 및 보인자 회수 촉진 기전(cofactor recovery promoting mechanism)으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 변형을 가진다. 본 발명의 추가적인 양태는 (R)-1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드로 (S)-1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드를 에피머화하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (S)-1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드를 적어도 하나의 효소와 접촉시키는 단계를 포함한다. (S)-1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드를 적어도 하나의 효소와 접촉시키는 단계는 (R)-1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드로 (S)-1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드를 전환시킨다. 본 발명의 또 다른 양태는 (R)-1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드로 (S)-1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드를 전환시키는 에피머라제를 생성하는 조작된 비식물 세포를 제공한다. 에피머라제는 표 1에 기재된 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 및 15로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 추가의 양태는 (R)-1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드로 (S)-1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드를 전환시키기에 충분한 양으로 에피머라제와 (S)-1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드를 접촉시키는 단계를 포함하는 (R)-1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드로 (S)-1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드를 전환시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드의 입체중심을 에피머화하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드를 적어도 하나의 효소와 접촉시키는 단계를 포함한다. 1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드와 적어도 하나의 효소를 접촉시키는 단계는 1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드의 입체중심의 입체화학을 1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드의 입체중심의 반대의 입체화학으로 뒤집는다. 몇몇 예에서, 조작된 비식물 세포는 표 2에 기재된 효소의 군으로부터 선택된 효소를 각각 코딩하는 복수의 코딩 서열을 포함한다. 몇몇 예에서, 비상동성 코딩 서열은 작동적으로 연결될 수 있다. 작동적으로 연결된 비상동성 코딩 서열은 특정한 벤질아이소퀴놀린 알칼로이드 생성물 및/또는 에피머라제 생성물을 생성하는 동일한 경로 내에 있을 수 있다. 본 발명의 추가적인 양태에서, 비스벤질아이소퀴놀린 알칼로이드를 생성하는 조작된 비식물 세포가 제공된다. 비스벤질아이소퀴놀린 알칼로이드는 조작된 비식물 세포 내에 존재하는 커플링 효소를 사용하여 생성된다. 게다가, 조작된 비식물 세포는 조작된 비식물 세포 내의 적어도 하나의 벤질아이소퀴놀린 알칼로이드 단량체의 생성에 사용된 적어도 하나의 효소를 코딩하는 적어도 하나의 비상동성 코딩 서열을 포함한다. 추가로, 적어도 하나의 커플링 효소는 조작된 비식물 세포 내에 2개의 벤질아이소퀴놀린 알칼로이드 단량체를 이합체화하고, 이로써 비스벤질아이소퀴놀린 알칼로이드를 형성한다. 참고에 의한 포함 본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 출원이 참고로 포함된 것으로 구체적으로 개별적으로 포함된 것과 동일한 정도로, 참고로 본 명세서에 포함된다. 본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구항에서 특별히 기재되어 있다. 본 발명의 특징 및 이점의 더 우수한 이해는 본 발명의 원칙이 이용되는 예시적인 실시형태를 기재한 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참고로 얻어질 것이고, 이 도면에서 도 1은, 본 발명의 실시형태에 따른, 테트라하이드로바이오프테린의 합성, 리사이클링 및 구조 경로의 예를 예시한다. 도 2는, 본 발명의 실시형태에 따른, 4-HPA, 도파민 및 3,4-DHPA로의 글루코스의 전환에 대한 생합성 계획을 예시한다. 도 3은, 본 발명의 실시형태에 따른, (R)-1-벤질아이소퀴놀린 알칼로이드 형성의 도식적 예를 예시한다. 도 4는, 본 발명의 실시형태에 따른, CYP-COR 효소의 아미노산 서열을 예시한다. 도 5는, 본 발명의 실시형태에 따른, 노르코클라우린을 통한 레티큘린으로의 L-타이로신의 전환에 대한 생합성 계획을 예시한다. 도 6은, 본 발명의 실시형태에 따른, 노르라우다노솔린을 통한 레티큘린으로의 L-타이로신의 전환에 대한 생합성 계획을 예시한다. 도 7은, 본 발명의 실시형태에 따른, 모르피난 알칼로이드로의 L-타이로신의 전환에 대한 생합성 계획을 예시한다. 도 8은, 본 발명의 실시형태에 따른, 프로토베르베린, 프탈리드아이소퀴놀린 및 베르베린 알칼로이드 생성물로의 L-타이로신의 전환에 대한 생합성 계획을 예시한다. 도 9는, 본 발명의 실시형태에 따른, 노스카핀, 노스카피노이드 및 프탈리드아이소퀴놀린 알칼로이드 생성물로의 L-타이로신의 전환에 대한 생합성 계획을 예시한다. 도 10은, 본 발명의 실시형태에 따른, 상귀나린 및 벤조페난트리딘 알칼로이드로의 L-타이로신의 전환에 대한 생합성 계획을 예시한다. 도 11a는, 본 발명의 실시형태에 따른, 노스카핀으로의 카나딘의 전환에 대한 생합성 계획을 예시한다. 도 11b는, 본 발명의 실시형태에 따른, 반합성 오피오이드의 생성에 대한 생합성 계획을 예시한다. 도 12는, 본 발명의 실시형태에 따른, 조작된 효모 균주에서 당으로부터의 노르코클라우린 생성을 개선하는 타이로신 수산화효소 돌연변이체를 예시한다. 도 13은, 본 발명의 실시형태에 따른, 조작된 효모 균주에서 당으로부터의 레티큘린 생성을 개선하는 타이로신 수산화효소 돌연변이체를 예시한다. 도 14는, 본 발명의 실시형태에 따른, 조작된 효모 균주에서 타이로신 수산화효소에 의한 L-도파 생성을 개선하는 다이하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase: DHFR)의 동시발현을 예시한다. 도 15는, 본 발명의 실시형태에 따른, (A) 조작된 효모 균주에서 타이로신 수산화효소에 의한 L-도파 생성을 개선하는 배양 배지에 대한 항산화제의 첨가 및 (B) BH4 수준을 증가시키는 배양 배지에 대한 항산화제의 첨가를 예시한다. 도 16은, 본 발명의 실시형태에 따른, (A) 비스BIA로의 L-타이로신의 전환을 위한 생합성 계획 및 (B) 비스BIA를 생합성하도록 조작된 효모 균주를 예시한다. 도 17은, 본 발명의 실시형태에 따른, 사이토크롬 P450 산화효소-코데이논 환원효소 유사(CYP-COR) 융합의 계통발생 나무를 예시한다. 도 18(A) 및 도 18(B)는, 본 발명의 실시형태에 따른, 살루타리딘으로 (S)-레티큘린을 전환시키도