KR-102961313-B1 - Markers for diagnosis of testicular disease in male dogs

Abstract

본 발명은 높은 특이도와 민감도로 부작용 없이 수컷 반려견의 생식기 질환을 신속하고 효과적으로 진단할 수 있는 수컷 반려견의 고환질환 진단용 마커를 제공한다.

Inventors

• 김건아

Assignees

• 을지대학교 산학협력단

Dates

Publication Date

20260506

Application Date

20230220

Claims (8)

1. miR-21, miR-23a, miR-23b, miR-26b, miR-27a, miR-27b, miR-28, miR-34a, miR-127, miR-148b, miR-149, miR-155, miR-197, miR-210, miR-221, miR-222, miR-224, miR-299, miR-324, miR-381, miR-383, miR-432, 및 miR-487b로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 마커의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 세르톨리 세포 종양 또는 정상피종을 포함하는 수컷 반려견의 고환질환 진단용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 제제는 상기 하나 이상의 miRNA에 특이적으로 결합하는 물질인, 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 물질은 상기 miRNA 또는 이의 상보적 염기서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인, 조성물.
4. 삭제
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 유효성분으로 포함하는, 세르톨리 세포 종양 또는 정상피종을 포함하는 수컷 반려견의 고환질환 진단용 키트.
6. 개체로부터 분리된 시료에서 miR-21, miR-23a, miR-23b, miR-26b, miR-27a, miR-27b, miR-28, miR-34a, miR-127, miR-148b, miR-149, miR-155, miR-197, miR-210, miR-221, miR-222, miR-224, miR-299, miR-324, miR-381, miR-383, miR-432, 및 miR-487b로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 마커의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 세르톨리 세포 종양 또는 정상피종을 포함하는 수컷 반려견의 고환질환 진단방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 측정된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 정상 개체에서 측정된 동일한 종류의 miRNA의 발현수준보다 높은 경우, 상기 개체가 고환질환에 걸린 것으로 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
8. 삭제

Description

수컷 반려견의 고환질환 진단용 마커{Markers for diagnosis of testicular disease in male dogs} 본 발명은 고환질환 진단용 마커에 관한 것으로서, 더 상세하게는 수컷 반려견의 고환질환 진단용 마커에 관한 것이다. 생식 기능은 개뿐만 아니라 인간도 나이가 들면서 감소한다. 사람의 경우 나이가 들면서 고환의 부피, 생식세포 및 세르톨리 세포의 수, 혈청 테스토스테론 수치, 및 정자 생존력이 감소하는 것은 잘 알려져 있다(Gunes, S. et al., J. Assist. Reprod. Genet. 33, 441-454, 2016). 연령과 정상 사정된 정자의 특성 사이에는 음의 상관관계가 있다는 보고가 있는데 특히, 종래 연구는 수컷 반려견에서 부고환 정자의 질과 생식력이 노화에 따라 감소한다고 보고하였다(Bhanmeechao, C. et al., Theriogenology, 108, 74-80, 2018). 또한 노령견의 신선 정액 및 해동 정액은 정자 운동성이 감소하고 미토콘드리아 기능이 저하되는 것으로 나타났다. 따라서 연령은 반려견을 포함한 수컷 불임의 가장 중요한 요인 중 하나이다. 한편, 잠복고환증(Cryptorchidism)은 수컷 반려견의 고환이 음낭 바닥으로 내려가지 못하는 가장 흔한 병리학적 상태를 말하며 0.8-10%의 유병률을 나타낸다(Birchard, S.J. et al., Compend. Contin. Educ. Vet. 30, 325-336; quiz 336-327. 2008). 종종 가벼운 기형으로 간주되지만 정상적인 하강 고환보다 온도가 상당히 높기 때문에 한쪽 잠복고환의 정액은 질이 떨어지거나 정상적인 정자를 생산할 수 없다. 또한 불임과 고환암의 특징을 잘 나타내는 위험 인자로 반려견의 건강에 심각한 영향을 미칠 수 있으며 고환종양과 관련이 있는 것으로 나타났다(Stokowski, S. et al., Front. Vet, Sci, 3, 33, 2016). 도 1은 편측성 잠복고환을 갖는 반려견의 잠복고환 상태 또는 비잠복고환 상태의 고환 및 부고환 조직을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색 후 현미경으로 관찰하여 비교한 결과를 나타내는 일련의 사진이다. (A) 및 (B)는 고환 조직을 나타내고 (C) 및 (D)는 부고환 조직을 나타낸다. 도 2는 1세 미만 미성견 및 3세 이상의 노령견으로부터 수득한 (A)고환 및 (B)부고환 샘플을 이용하여 miRNA 볼륨 플롯 분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다. 볼케이노 플롯(volcano plot)은 건강한 미성견과 노령견 사이의 배수 변화와 부피를 나타낸다. 수평선은 2배 변화 차이를 나타내고 빨간색 점은 비교를 위한 상위 5개 miRNA의 유의성을 의미한다. 파란색 및 하늘색 점은 p<0.05 없이 2배 변화 차이 이상의 유의성을 의미하고 회색 점은 부피와 배수 변화 사이의 상관관계에 의미가 없음을 나타낸다. cfa-miR = Canis lupus familaris microRNA. 도 3은 1세 미만 미성견 및 잠복고환을 가진 반려견으로부터 수득한 (A)고환 및 (B)부고환 샘플을 이용하여 miRNA 볼륨 플롯 분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다. 볼케이노 플롯은 그룹 간의 배수 변화와 부피를 나타내고 수평선은 2배 변화 차이를 나타낸다. 빨간색 점은 비교를 위한 상위 5개 miRNA의 유의성을 의미하고 파란색 및 하늘색 점은 p<0.05 없이 2배 변화 차이 이상의 유의성을 의미하며 회색 점은 부피와 배수 변화 사이의 상관관계에 의미가 없음을 나타낸다. cfa-miR = Canis lupus familaris microRNA. 도 4는 1세 미만 미성견 및 고환 종양을 가진 노령견으로부터 수득한 샘플을 이용하여 miRNA 볼륨 플롯 분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다. (A)는 세르톨리 세포 종양 및 (B)는 정상피종을 갖는 고환 샘플을 사용하였다. 볼케이노 플롯은 건강한 미성견 및 노령견 사이의 배수 변화와 부피를 나타낸다. 수평선은 2배 변화 차이를 나타내고 빨간색 점은 비교를 위한 상위 5개 miRNA의 유의성을 의미한다. 하늘색 점은 p<0.05 없이 2배 변화 차이 이상의 유의성을 의미하며 회색 점은 부피와 배수 변화 사이의 상관관계에 의미가 없음을 나타낸다. cfa-miR = Canis lupus familaris microRNA. 도 5는 고환 종양 및 정상 고환의 세 가지 샘플을 이용하여 miRNA 발현 패턴을 분석한 결과를 벤 다이어그램으로 나타내는 그림이다. 세 그룹(정상, 세르톨리 세포 종양 및 정상피종) 간의 비교에서 관찰된 차등적으로 발현된 miRNA를 나타낸다. 숫자는 표시된 영역의 miRNA 수를 나타내고 표는 각 그룹의 비교에 의해 식별된 miRNA를 나타내며 빨간색 miRNA는 차별적으로 상향 조절되고 파란색 miRNA는 하향조절된다. 녹색 miRNA는 한 비교에서 상향조절되었으며 각 비교 그룹에서 모순된 결과를 보였지만 다른 비교에서는 하향조절되었다. 용어의 정의: 본 문서에서 사용되는 "잠복고환(cryptorchidism)"은 성숙한 개에서 한쪽 또는 양쪽의 고환이 정상적으로 음낭 안으로 하강되지 않고 복강 내에 잠복해 있어 성적 기능장애를 유발하는 질병을 말한다. 원인은 명확하지 않고 발생학적, 내분비학적, 유전적 요인이 작용하는 것으로 추정한다. 대부분의 동물에서 관찰되며 개는 1.2%, 고양이는 1.7%에서 발생 보고되었고 개는 모든 품종에서 발생된다고 보고하였다. 호발 품종으로 토이푸들, 포메라니안, 요크셔테리어 등 소형견종으로 우측 고환의 잠복이 더 흔하다. 본 문서에서 사용되는 "마이크로 RNA(miRNA)"는 비-암호화된 18-25 뉴클레오티드 길이의 작은 RNA로서, 유전자 발현의 주요한 내생적 조절자이다. miRNA는 표적 mRNA의 3' 비번역 영역(3'-UTR)에 결합하여 번역 억제 또는 mRNA 분해를 유도하여 표적 유전자의 발현을 저해한다. miRNA로 추정되는 약 1,500종의 RNA가 밝혀졌고, 포유류 유전자의 최대 30% 정도가 miRNA로 조절되는 것으로 예측된다. miRNA는 포유동물 종 사이에서 고도로 보존되어 있으며 조직 특이적 발현을 나타내는 것으로 알려져 있어 miRNA 바이오 마커는 특정 질병을 모니터링 하기 위한 용도로 큰 잠재력을 가지고 있다. 본 문서에서 사용되는 "세르톨리 세포 종양(Sertoli cell tumor)"은 개에서 유발되는 일반적인 고환종양으로 잠복고환 및 기타 원인으로 발생한다. 10~14%에서 악성이고 국소적인 림프절, 또 다른 복부, 흉부장기에 전이된다. 본 문서에서 사용되는 "정상피종(Seminoma)"은 개에서 가장 빈번하게 발생하는 고환 종양으로 난소의 미분화배세포종과 동일하다. 정상피종이 전이되는 증례는 많지 않으나 정삭의 림프관과 정맥을 따라 장골 림프절과 요추림프절에 전이되어 폐나 복강내 장기에 전이되는 경우가 있다. 발명의 상세한 설명 본 발명의 일 관점에 따르면, miR-21, miR-23a, miR-23b, miR-26b, miR-27a, miR-27b, miR-28, miR-34a, miR-127, miR-148b, miR-149, miR-155, miR-197, miR-210, miR-221, miR-222, miR-224, miR-299, miR-324, miR-381, miR-383, miR-432, 및 miR-487b로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 마커의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 수컷 반려견의 고환질환 진단용 조성물이 제공된다. 상기 조성물에 있어서, 상기 제제는 상기 하나 이상의 miRNA에 특이적으로 결합하는 물질일 수 있고 상기 물질은 상기 miRNA 또는 이의 상보적 염기서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며 상기 고환질환은 고환 종양(testicular tumor), 세르톨리 세포 종양(sertoli cell tumor) 또는 정상피종(seminoma)일 수 있다. 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는, 수컷 반려견의 고환질환 진단용 키트가 제공된다. 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 개체로부터 분리된 시료에서 miR-21, miR-23a, miR-23b, miR-26b, miR-27a, miR-27b, miR-28, miR-34a, miR-127, miR-148b, miR-149, miR-155, miR-197, miR-210, miR-221, miR-222, miR-224, miR-299, miR-324, miR-381, miR-383, miR-432, 및 miR-487b로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA 마커의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 수컷 반려견의 고환질환 진단방법이 제공된다. 상기 진단방법에 있어서, 상기 고환질환은 고환 종양(testicular tumor), 세르톨리 세포 종양(sertoli cell tumor) 또는 정상피종(seminoma)일 수 있다. 고환암은 세계보건기구(WHO)가 제정한 분류체계에 따라 1977년 이후부터 종자세포종양과 비종자세포종양으로 분류되는데 종자세포종양은 크게 정상피종(seminoma)과 비정상피종(non-seminoma)으로 나뉘며, 상기 비정상피종은 다시 배아암(embryonal carcinoma), 난황주머니종양(yolk sac tumor), 융모막암종(choriocarcinoma), 기형종(teratoma)으로 세분화되고 있다. 또한 상기 비종자세포종양은 레이디히(leydig) 세포 종양, 세르톨리 세포 종양, 생식샘 모세포종(gonadoblastoma) 및 전이성 또는 속발성 종양으로 분류할 수 있다. 수컷 반려견에서 고환 종양(testicular tumor)의 발생률은 정상 고환보다 잠복고환(cryptorchid testicles)에서 약 13배 높은 것으로 보고되었다(Johnson, S.L. et al., Ageing. Res. Rev. 19, 22-33, 2015). 고환 종양은 양성(benign)이지만 종양 세포에 의해 생성되는 내인성 에스트로겐의 증가는 생명을 위협할 수 있는 여성화 및 골수 억제 증후군을 야기할 수