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KR-102961926-B1 - ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES THAT BIND TO EXON 51 OF HUMAN DYSTROPHIN PRE-MRNA

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Abstract

본 발명은 엑손 스키핑을 유도하기 위하여 인간 디스트로핀 전-mRNA의 엑손 51에 결합하는 치료용 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 및 DMD의 치료를 위한 이의 컨쥬게이트 및 조성물에 관한 것이다.

Inventors

  • 요코타, 토시후미
  • 에치고야, 유스케

Assignees

  • 더 거버너스 오브 더 유니버시티 오브 알버타

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20180720
Priority Date
20170721

Claims (20)

  1. 인간 디스트로핀 전-mRNA(dystrophin pre-mRNA)의 엑손 51에 결합하고 엑손 스키핑을 유도할 수 있는 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드(morpholino oligonucleotide)로서, 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1(AcO), 서열번호 3(Ac26), 및 서열번호 4(Ac30)로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열의 적어도 27개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하고, 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드는 길이로 27개 내지 30개 뉴클레오타이드이고, 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드는 이의 전체 길이에서 서열번호 1, 3 및 4 중 하나와 100% 서열 상동성을 갖는, 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드.
  2. 인간 디스트로핀 전-mRNA의 엑손 51에 결합하고 엑손 스키핑을 유도할 수 있는 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드로서, 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1(AcO), 서열번호 2(Ac5), 서열번호 3(Ac26), 서열번호 4(Ac30) 및 서열번호 5(Ac48)로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열로 구성되는 것인 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 따른 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드 및 담체를 포함하는 컨쥬게이트로서, 담체가 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드에 컨쥬게이션되어 있는, 컨쥬게이트.
  4. 제3항에 있어서, 담체는 모로폴리노 올리고뉴클레오타이드를 표적 세포로 수송하도록 작동 가능한(operable) 것인 컨쥬게이트.
  5. 제4항에 있어서, 담체는 펩타이드, 소분자 화학물질, 중합체, 나노입자, 지질, 리포솜, 세포 침투 펩타이드, 아르기닌-풍부 세포 침투 펩타이드 또는 엑소좀으로부터 선택되는 것인 컨쥬게이트.
  6. 제3항의 컨쥬게이트가 로딩된 세포.
  7. 제1항 또는 제2항에 따른 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 근육 장애(muscular disorder)를 치료하기 위한 약학 조성물.
  8. 제3항에 따른 컨쥬게이트, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 근육 장애를 치료하기 위한 약학 조성물.
  9. 대상체에서 근육 장애(muscular disorder)의 치료에 사용하기 위한, 인간 디스트로핀 전-mRNA의 엑손 51에 결합하여 엑손 스키핑을 유도할 수 있는 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드로서, 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1(AcO), 서열번호 3(Ac26), 및 서열번호 4(Ac30)로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열의 적어도 27개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하고, 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드는 길이로 27개 내지 30개 뉴클레오타이드이고, 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드는 이의 전체 길이에서 서열번호 1, 3 및 4 중 하나와 100% 서열 상동성을 갖는, 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드.
  10. 대상체에서 근육 장애의 치료에 사용하기 위한, 인간 디스트로핀 전-mRNA의 엑손 51에 결합하여 엑손 스키핑을 유도할 수 있는 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드로서, 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 1(AcO), 서열번호 2(Ac5), 서열번호 3(Ac26), 서열번호 4(Ac30) 및 서열번호 5(Ac48)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열로 구성되는 것인 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 근육 장애는 근육 기능과 관련된 유전자의 유전자 돌연변이로부터 유발되는 장애, 듀시엔형 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy) 또는 베커형 근이영양증(Becker muscular dystrophy)인 것인 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드.
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Description

인간 디스트로핀 전-ｍＲＮＡ의 엑손 51에 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드{ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES THAT BIND TO EXON 51 OF HUMAN DYSTROPHIN PRE-MRNA} 관련 출원에 대한 상호 참조 본 출원은 2017년 7월 21일에 출원된 GB 1711809.2에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원의 내용은 본원에 참조로 포함된다. 기술분야 본 발명은 엑손 스키핑(exon skipping)을 유도하기 위하여 인간 디스트로핀 전-mRNA의 엑손 51에 결합하는 치료용 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 및 이의 컨쥬게이트(conjugate) 및 조성물에 관한 것이다. 발명은 추가로 근육 장애, 특히 듀시엔형 근이영양증(Duchenne Muscular Dystrophy)의 치료를 위한 방법 및 이를 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다. 선택적 스플라이싱(alternative splicing)의 중단(disruption)은 많은 질환의 기저에 있으며, 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 스플라이싱을 조절하는 것은 치료적 의미를 가질 수 있다. 스플라이스-스위칭 안티센스 올리고뉴클레오타이드(splice-switching antisense oligonucleotide, SSO)는 신경근육 질환에 대한 새로운 치료법으로, 현재 몇몇의 SSO가 척수성 근위축증(spinal muscular atrophy, SMA) 및 듀시엔형 근이영양증(DMD)과 같은 상태에 대해 임상 실험을 진행중에 있고, 여기에서 안티센스-매개성 엑손 스키핑은 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 복원하고, 비기능성 단백질 대신 부분적으로 또는 전체적으로 기능성인 단백질의 합성을 가능하게할 수 있다. 듀시엔형 근이영양증(DMD)은 전세계의 소년들에서 가장 흔한 치명적인 유전적 장애 중 하나로, 출생한 남아 3,600 내지 9,337명 중 대략 1명의 발생률을 가진다. DMD는 디스트로핀(DMD) 유전자의 돌연변이로 인한 디스트로핀 단백질의 부재에 의해 유발된다. 이 단백질을 암호화하는 유전자는 2백만 개 이상의 DNA의 뉴클레오타이드에 걸쳐 퍼져 있는 79개의 엑손을 함유한다. 엑손의 리딩 프레임을 변화시키거나, 또는 정지 코돈을 도입하거나, 또는 아웃 오브 프레임(out of frame) 엑손 또는 엑손들 전체 또는 하나 이상의 엑손의 중복(duplication)의 제거를 특징으로 하는 임의의 엑손성 돌연변이(exonic mutation)는 기능성 디스트로핀의 생성을 방해하여 DMD를 초래할 가능성이 있다. 덜 심각한 형태의 근이영양증인 베커형 근이영양증(Becker muscular dystrophy, BMD)은 돌연변이, 전형적으로 하나 이상의 엑손의 결실이 전체 디스트로핀 전사체(transcript)를 따라 정확한 리딩 프레임을 생성하여 mRNA의 단백질로의 번역이 조기에 종결되지 않는 경우에 발생하는 것으로 밝혀졌다. 돌연변이된 디스트로핀 전-mRNA의 프로세싱에서 상류 및 하류 엑손의 결합이 유전자의 정확한 리딩 프레임을 유지하는 경우, 결과는 일부 활성을 유지하는 짧은 내부 결실을 갖는 단백질을 코딩하는 mRNA가 베커 표현형을 초래한다. 디스트로핀 단백질의 리딩 프레임을 변경시키지 않는 엑손 또는 엑손들의 결실은 BMD 표현형을 발생시키는 반면, 프레임 이동(frame-shift)을 유발하는 엑손 결실은 DMD를 발생시킬 것이다(Monaco, Bertelson et al. 1988). 일반적으로, 리딩 프레임을 변화시켜 적절한 단백질 번역을 방해하는 점 돌연변이 및 엑손 결실을 포함하는 디스트로핀 돌연변이는 DMD를 야기한다. 현재 가장 유망한 치료 방안 중 하나는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide, AO)를 사용하는 엑손 스키핑이다. 엑손 스키핑은 DMD 전-mRNA로부터 돌연변이 엑손 및/또는 이의 플랭킹(flanking) 엑손(들)을 제거함으로써 리딩 프레임을 복원할 수 있으며, 절단되었지만 부분적으로 기능성인 디스트로핀 단백질의 생성을 가능하게 한다. 대부분의 DMD 환자는 결실 돌연변이를 가지고 있으며, 이들 중 20%는 엑손 51 스키핑이 가능하다. 2016년 9월, 미국 식품의약국(FDA)은 돌연변이체 DMD로부터 엑손 51을 배제하도록 개발된, 첫 번째 DMD 안티센스 약물인 에테플러센(eteplirsen, Exondys 51)을 조건부로 승인하였다. 에테플러센은 안전성 및 유효성의 관점에서 잘 확립되어 있는 안티센스 화학물질인, 포스포로다이아미데이트 모르폴리노 올리고머(모르폴리노 또는 PMO)로 변형된 AO이다. 그러나, 에테플러센은 디스트로핀 단백질을 치료적으로 유익한 수준으로 복구하며 임상 결과를 개선한다는 두 가지 관점에서 약물의 유효성을 지지하는 증거가 불충분하기 때문에, 여전히 논란이 많다. FDA는 DMD 엑손 51 스키핑에 대한 또 다른 약물 후보물질인 2'-O-메틸-포스포로티오에이트-기반 AO인 '드리사퍼센(drisapersen)'을 이전에는 승인하지 않았다. 치료제는 가장 적은 위험으로 가능한 최대의 이익을 보장해야 하지만, 드리사퍼센으로 치료할 때 근육 기능에서 유의한 개선이 입증되지 않았으며, 이의 사용은 안전성에 대한 우려로 이어졌다. 그러므로, 엑손 스키핑 치료법은 현재 많은 동물 연구에서 상당한 치료 효과가 입증되었다는 사실에도 불구하고, 환자에서 관찰된 이의 효능이 매우 낮다는 점에서 주요 도전에 직면하고 있다. 엑손 스키핑 효율은 AO 표적 서열에 크게 좌우된다: 그러나, 에테플러센 및 드리사퍼센에 의해 표적화된 서열이 엑손 스키핑 치료법에 대한 최적의 선택이 아닐 수도 있다는 토론이나 논의는 거의 없었다. 몇몇 그룹은 효과적인 AO 서열을 계산적으로 그리고 경험적으로 결정하기 위하여 대규모 AO 스크리닝 노력을 해왔다. 그러나, 설계된 AO의 엑손 스키핑 유효성은 정량적으로나 통계학적으로 평가되지 않았다. 이영양성 근육 기능을 개선하기 위해 디스트로핀 단백질 발현을 복구시키는 것이 필요하지만, AO가 디스트로핀 단백질 발현을 구제(rescue)하는 능력은 이전의 AO 스크리닝 연구에서 충분한 정량화 방법으로는 보고되지 않았다. 다른 연구는 일차 DMD 근육 세포로부터의 RT-PCR에 크게 의존하였다. 에테플러센 및 드리사퍼센의 AO 서열은 이런 맥락 내에서만 결정되었다는 것이 주목할만하다. 그러므로, 엑손 51 스키핑 치료법의 유효성은 보다 최적의 AO 서열을 선택하고, 임상 시험에서 앞으로 나아갈 최상의 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 검증하기 위해 보다 신뢰성 있고 직접적인 생물학적 척도 - 예컨대 DMD에서 구제된 디스트로핀 단백질 - 를 사용하여 보다 엄격한 AO 스크리닝을 수행함으로써 개선될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예는 이제 다음의 도면 및 표를 참조로 기술될 것이다: 도 1은 불멸화된 클론 엑손 52-결실 DMD 골격근 세포(KM571)에서, 10 μM의 에테플러센(aEte) 및 드리사퍼센(aDri)의 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AO) 및 유사체 AO의 시험관 내 스크리닝을 나타낸다. 분화된 근관은 형질감염 후 5일째에 수득되었다. (A) 원스텝 RT-PCR에 의해 측정된 엑손 51 스키핑의 효율. 대표적인 이미지를 나타내었다. M, 100 bp 마커; 블랭크, RNA 주형 없음. (B) 항-디스트로핀 C-말단 항체를 사용한 정량적 웨스턴 블롯팅에 의해 측정된 절단된 디스트로핀 단백질 유도의 효율. 구제된 디스트로핀 단백질 수준은 건강한 8220개 세포를 이용한보정 곡선을 사용하여 계산되었다. 데이터는 3 내지 4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SD를 나타낸다. ** p<0.01 vs aEte,† p<0.05 및 †† p<0.01 vs aDri, §§ p < 0.01 vs (A)의 모든 AO 및 vs (B)의 AcO. 도 2는 5 μM의 에테플러센 및 드리사퍼센의 AcO, Ac48, 및 유사체 AO로 형질감염된 엑손 52-결실 DMD-KM571 세포주에서 디스트로핀 엑손 51 스키핑 및 단백질의 경시적 분석을 나타낸다. 샘플은 형질감염 후 2일 및 11일째에 수집되었다. (A) 엑손 51 스키핑의 RT-PCR 분석. M, 100 bp 마커; R, 복제 수; 블랭크, RNA 주형 없음. (B) 항-디스트로핀 C-말단 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의한 유도된 디스트로핀 단백질의 정량화. 3개의 독립적인 실험으로부터의 대표적인 복제물을 나타낸다. 도 3은 원스텝 RT-PCR 및 정량적 웨스턴 블롯팅에 의해 측정된 불멸화된 DMD 골격근 세포에서 에테플러센 및 드리사퍼센의 AcO, Ac48, 및 유사체 AO의 용량 의존적 효과를 나타낸다. DMD 골격근 세포는 1, 3, 및 10 μM의 AO로 형질감염시키고, 형질감염 후 5일째에 수득되었다. (A) 및 (B)는 각각 엑손 52 결실 돌연변이(ID KM 571)를 갖는 DMD 근육 세포에서 구제된 디스트로핀 단백질의 엑손 51 스키핑 효율 및 발현 수준을 나타낸다. 엑손 51을 스키핑하고 디스트로핀 단백질 발현을 구제하는 효능은 각각 엑손 48 내지 50 결실 돌연변이를 가지는 DMD 근육 세포(ID 6594)에서 (C) 및 (D)로 나타낸다. 데이터는 KM571 세포주에서의 3 내지 7개의 독립적인 실험으로부터, 그리고 6594 세포주에서의 3 내지 4개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± SD를 나타낸다. * p<0.05, ** p<0.01 vs aEte;† p<0.05 및 †† p<0.01 vs Ac48; § p<0.05, §§ p<0.01 vs 동일한 농도의 aDri, NS, 유의성 없음 vs 다음 용량의 AcO; ns, 유의성 없음 vs 10 μM의 AcO. (E) 회귀 모델에 의해 분석된 AO에 대한 용량-반응성. 스키핑 및 디스트로핀 단백질 생성에서의 회귀 방정식의 통계학적 타당성(statistical validity)은 각각 p<0.008 및 p<0.014였다. 플롯은 회귀 분석에서 예측된 엑손 스키핑 또는 디스트로핀 단백질 수준의 값을 나타낸다. 회귀 기울기 및 95% 신뢰 구간(CI)을 개별 AO로 나타난다. 도 4는 엑손 52(ID KM571) 및 엑