Search

KR-20260060488-A - Composition for differentiation of mesenchymal stem cells into chondrocytes

KR20260060488AKR 20260060488 AKR20260060488 AKR 20260060488AKR-20260060488-A

Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포에서 연골세포로의 분화용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 아드레노메둘린(Adrenomedullin)은 중간엽 줄기세포에서 연골세포로의 분화 과정에서 연골세포 분화와 관련된 유전자인 Sox9(SRY-box transcription factor 9), Col2A1(Collagen Type II Alpha 1) 및 Acan(Aggrecan)의 발현을 증가시키므로, 아드레노메둘린(Adrenomedullin)을 유효성분으로 포함하는 조성물을 중간엽 줄기세포에서 연골세포로의 분화용 조성물로 이용할 수 있다.

Inventors

  • 김태민
  • 홍성옥

Assignees

  • 서울대학교산학협력단

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20241024

Claims (7)

  1. 아드레노메둘린(Adrenomedullin)을 유효성분으로 포함하는 중간엽 줄기세포에서 연골세포로의 분화용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아드레노메둘린은 중간엽 줄기세포에서 연골세포로의 분화 과정에서 Sox9(SRY-box transcription factor 9), Col2A1(Collagen Type II Alpha 1) 및 Acan(Aggrecan)의 발현을 증가시키는 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 상기 아드레노메둘린을 1 × 10 -10 내지 1 × 10 -5 M의 농도로 포함하는 것인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 중간엽 줄기세포는 피부, 편도, 치수, 지방조직, 골수, 제대, 제대혈, 태반, 혈액, 활액막, 골막 또는 연골막에서 유래된 것인, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 배지에서 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포에서 연골세포로의 분화 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 조성물을 포함하는 배지에서 중간엽 줄기세포를 배양하는 기간은 3일 내지 21일인 것인, 분화 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 연골 질환의 치료를 위한 세포 치료제의 병용 투여용 약학적 조성물.

Description

중간엽 줄기세포에서 연골세포로의 분화용 조성물 {Composition for differentiation of mesenchymal stem cells into chondrocytes} 본 발명은 중간엽 줄기세포에서 연골세포로의 분화용 조성물에 관한 것이다. 골관절염은 연골세포의 비가역적인 손실을 특징으로 하는 난치성 질환으로, 현재 미충족 의료 수요가 높은 상태이다. 연골세포는 과도한 운동, 노화, 자가면역질환 등에 의해 손상되기 쉬우며, 지속적인 자극에 의해 손상될 경우 재생이 거의 이루어지지 않는다. 이러한 배경에서, 건강한 연골세포를 확보하여 치료에 활용하는 것이 중요한 과제로 대두되고 있다. 글로벌 재생의료 개발기업 수는 유전자, 세포 및 조직 기반 치료제 기업을 모두 포함하여 2021년 기준 총 2,541개사로 파악되고 있으며, 현재 전세계적으로 1,947건의 임상이 이루어지고 있으며, 그 중 임상 3상은 116건(5.8%)이고, 치료제 분류별로 살펴보면, 유전자치료제 589건, 세포기반면역항암제 833건, 세포치료제 568건, 조직공학제제 14건으로 조사됨. 전체적으로, 세포기반 면역항암제(Cell-based immuno-oncology)의 비중이 41.6%로가장 큰 비중을 차지하는 것으로 나타나고 있다[1]. 골관절염 치료제 연구에 있어, 중간엽 줄기세포는 분리가 용이하며, 연골분화능을 가지고 있고 항염효과를 지니고 있기 때문에 이를 이용한 골관절염 치료제 개발 연구가 활발히 이루어지고 있다. 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cell, MSC)는 골수, 제대조직, 지방조직 및 거의 모든 장기에 존재하며, 중간엽 유래 여러 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있다. 특히, 중간엽 줄기세포에서 연골세포로의 분화능력에 착안하여 연골손상 치료법 개발 연구가 활발히 진행되고 있다. 다수의 연구 결과에 따르면, MSCs 유래 연골세포가 골관절염의 치료에 도움을 줄 수 있다는 것이 밝혀졌다. 그러나 중간엽 줄기세포를 이용한 연골세포 분화 및 치료법 개발에는 여러 가지 과제가 존재한다. 중간엽 줄기세포에서 연골세포로의 분화는 배양 조건에 크게 영향을 받는다[2]. 특히, 펠렛(pellet) 또는 드롭(drop) 배양 조건에서는 3차원 세포구조물 내부의 최적 이하의 산소농도, 성장인자의 소모 등으로 인해 분화효율이 저하될 수 있다. 또한, 미분화된 MSC를 직접 사용할 경우, 안전성 문제가 제기된다. 이는 중간엽 줄기세포가 의도하지 않은 다른 세포 유형으로 분화하거나 종양원으로 작용할 가능성이 있기 때문이다. 따라서, 중간엽 줄기세포에서 연골세포로의 분화기술을 향상시키는 것이 골관절염 치료법 개발에 있어 중요한 과제로 떠오르고 있으나, 연골세포 분화에 있어 분화 효율을 향상시킬수 있는 구체적인 인자에 대한 연구가 부족한 상태이다. 아드레노메둘린(Adrenomedullin, ADM)은 1993년 처음 발견된 52개의 아미노산으로 구성된 펩티드 호르몬으로, 주로 부신 수질에서 분비되지만, 심장, 폐, 신장 등 여러 조직에서도 생성된다. 아드레노메둘린은 강력한 혈관 확장 작용을 가지고 있어 혈압 조절에 중요한 역할을 하며, 또한 항염증, 항산화, 세포 보호 등의 다양한 생리학적 기능을 수행한다. 임상적으로 아드레노메둘린은 심혈관 질환, 신장 질환, 패혈증 등 여러 질병의 진단 및 예후 평가에 유용한 바이오마커로 주목받고 있다. 그러나, 골관절염 치료에 있어서 아드레노메둘린의 역할, 특히 중간엽 줄기세포에서 연골세포로의 분화 과정에서의 역할에 대해선 알려진 바가 없다. 도 1은 중간엽 줄기세포에서 연골세포로의 펠렛(pellet) 조건 분화 과정에서 아드레노메둘린(ADM) 첨가 후 펠렛 크기와 알시안 블루 염색 결과를 확인한 도이다. 도 2는 중간엽 줄기세포에서 연골세포로의 펠렛(pellet) 조건 분화 과정에서 아드레노메둘린(ADM) 첨가 후 펠렛의 직경 길이를 측정한 도이다. 도 3은 중간엽 줄기세포에서 연골세포로의 펠렛(pellet) 조건 분화 과정에서 아드레노메둘린(ADM) 첨가 후, 연골세포 분화효율을 침착된 알시안 블루 염색액의 흡광도를 통해 비교한 도이다. 도 4는 중간엽 줄기세포에서 연골세포로의 펠렛(pellet) 조건 분화 과정에서 아드레노메둘린(ADM) 첨가 후 연골세포 분화마커 유전자의 mRNA 발현을 RT-qPCR를 통하여 계산한 결과를 나타낸 도이다. 도 5는 중간엽 줄기세포에서 연골세포로의 드롭(drop) 조건 분화 과정에서 아드레노메둘린(ADM) 첨가에 따라 형성되는 연골 드롭 조직 모양을 확인한 도이다. 도 6은 중간엽 줄기세포에서 연골세포로의 드롭(drop) 조건 분화 과정에서 아드레노메둘린(ADM) 첨가에 따라 형성되는 드롭(drop) 형성 비율을 비교한 것이다. 이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 일 양태는 아드레노메둘린(Adrenomedullin)을 유효성분으로 포함하는 중간엽 줄기세포에서 연골세포로의 분화용 조성물에 관한 것이다. 용어 "아드레노메둘린(Adrenomedullin, ADM)"은 52개의 아미노산으로 구성된 펩티드 호르몬으로, 크롬친화세포종 (pheochromocytoma)으로부터 발견된 펩타이드이며 염증환경에서 분비된다[3]. 상기 ADM은 처음에는 부신 수질에서 발견되었으나, 이후 다양한 조직에서도 그 존재가 확인되었다. 아드레노메둘린은 N-말단에 6개의 아미노산으로 이루어진 고리 구조와 C-말단의 아미드화된 타이로신을 특징으로 하는 구조를 가지고 있다. 이 호르몬은 혈관 확장, 혈압 조절, 신경 전달, 호르몬 조절 등 다양한 생리학적 기능을 수행하며, 주로 칼시토닌 수용체 유사 수용체(CRLR)와 수용체 활성 조절 단백질(RAMP)의 복합체를 통해 작용한다. ADM은 cAMP를 증가시켜 PKA 경로를 촉진한다는 보고가 있다. 또한, 세포 내 칼슘이온을 증가시키고 혈관내피세포의 산화질소합성효소(nitric oxide synthase, eNOS)를 증가시키고, 결과으로 혈관을 확장시키는 기능을 하는 것으로 알려져 있다[4]. 랫드 조직에서의 ADM은 부신, 심장, 폐, 신장에서 과량으로 분비되며[5], 특히, ADM 섬유아세포, 혈관평활근, 혈관내피세포, 단핵구, 대식세포, 호중구에서 주로 분비된다[6]. 랫드 뇌졸중 모델에서 중간엽 줄기세포와 ADM을 동시에 혼합하여 주입될 경우 치료효과가 올라가는 결과가 있으며[7], 아데노바이러스벡터에 의한 ADM 유전자가 도입된 중간엽 줄기세포는 세포증식과 생존율이 올라가는 보고가 있으며[8], 중간엽 줄기세포의 지방세포 분화 과정에서 ADM의 발현이 올라가는 결과가 보고되었다[9, 10]. 염증인자와 관련하여서는, IL-6을 촉진하고, TNF-a를 억제하여 염증을 조절하고, 세포사멸을 조절할 뿐만 아니라 종양에서 혈관형성을 촉진한다[11,12]. 신장조직의 중간막세포(mesangial cell)에서, ADM은 cAMP/PKA를 활성화시키며, ROS 생성을 감소시키며, 세포의 증식을 억제함이 보고되었고, MAPK 경로에 의하여 혈관평활근의 증식이 억제됨이 보고되었다[13]. 혈관평활근에서 ADM의 효과는 context에 따라 달라지는데, PDGF가 존재할 경우에는 세포의 증식과 이동을 억제하는 반면에, PDGF가 존재하지 않을 경우에는 세포의 증식을 촉진함이 보고되었다[14]. 분화이외의 연구에서는 인간 관절연골세포에서 ADM은 10-9 내지 10-5 M 농도 범위에서 세포분열이 억제됨이 보고되었고[15], 이와 상반된 결과로, ADM은 10-10, 10-9, 또는 10-8 M 농도에서 개 연골세포의 증식이 촉진됨이 보고되었으며[16], in vitro 단계에서 세포에 처리되는 ADM의 농도는 통상적으로 1x10-6 M 이하 수준에서 다루어졌다[17]. 다른 연구에서는, ADM이 신경줄기세포가 성상세포, 희돌기교세포로의 분화를 촉진하였다[18]. 이와 같이, 다양한 ADM 농도범위에서 초기 연구가 이루어졌었다. 그러나 상반된 연구 결과의 원인을 떠나서, 중간엽 줄기세포의 연골세포 분화 과정에서 ADM에 의한 연골분화 효율에 관한 연구결과는 보고된 바 없다. 본 발명에서 아드레노메둘린은 특히 연골세포의 분화 과정을 조절하는 핵심 인자로서 중요성을 갖는다. 여기서 언급되는 아드레노메둘린은 천연 아드레노메둘린뿐만 아니라 그의 기능적 유사체, 변이체, 또는 유도체를 포함한다. 이는 아미노산 서열의 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 가지면서 연골세포 분화에 있어 유사한 생물학적 활성을 나타내는 모든 펩티드를 포함하는 것으로 정의된다. 본 발명에서 아드레노메둘린은 중간엽 줄기세포에서 연골세포로의 분화 과정에서 Sox9(SRY-box transcription factor 9), Col2A1(Collagen Type II Alpha 1) 및 Acan(Aggrecan)의 발현을 증가시키는 것을 규명하였다. 용어 "Sox9(SRY-box transcription factor 9)"은 HMG-box 계열에 속하는 전사 인자로, 연골 발생 및 분화의 중요한 역할을 하는 마스터 레귤레이터이다. Sox9은 Col2A1, Col11A2, Acan 등의 연골 특이적 유전자의 프로모터 영역에 직접 결합하여 전사를 활성화한다. 또한, Sox9은 TGF-β/Smad 신호 전달 경로와 상호작용하며, BMP-2와 협력하여 연골 형성을 촉진한다. Sox9의 발현은 L-Sox5와 Sox6와 함께 Sox 트리오를 형성하여 시너지 효과를 나타내며, 이는 연골 세포의 최종 분화에 필수적이다. 용어 "Col2A1(Collagen Type II Alpha 1)"은 연골 특이적 세포외 기질 단백질을 코딩하는 유전자로, 제2형 콜라겐 분자의 pro-α1(II) 사슬을 생성한다. 이 유전자는 54개의 엑손으로 구성되어 있으며, 선택적 스플라이싱을 통해 IIA와 IIB 두 가지 주요 아이소폼을 생성한다. IIA 형태는 주로 연골 전구 세포에서 발현되는 반면, IIB 형태는 성숙한 연골 세포에서 우세하게 발현된다. Col2A1의 전사는 Sox9에 의해 직접적으로 조절되며, 그 프로모터 영역에는 Sox9 결합 부위가 여러 개 존재한다.