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KR-20260060498-A - Gene-editing tool for breeding tomato with Micro-Tom-like architecture and molecular marker for the same

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Abstract

본 발명은 토마토의 Micro-Tom 초형화 육종을 위한 유전자 편집 도구 및 분자마커에 관한 것으로, 토마토 Solyc06g074350 ; Solyc05g053850 ; Solyc01g066980 ; 및 Solyc02g089160 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 DNA;를 포함하는, 줄기마디 길이가 감소되고 개화시기가 촉진된 토마토 식물체의 제조를 위한 유전자 교정용 조성물 및 상기 토마토 Solyc06g074350 ; Solyc05g053850 ; Solyc01g066980 ; 및 Solyc02g089160 유전자의 유전자형을 판별할 수 있는 분자마커에 관한 것이다.

Inventors

  • 박순주
  • 라영숙
  • 이준우
  • 강혜영

Assignees

  • 경상국립대학교산학협력단
  • 주식회사 토마토바이오텍

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20241024

Claims (12)

  1. 토마토( Solanum lycopersicum ) Solyc06g074350 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA (guide RNA) 또는 이를 암호화하는 DNA; 토마토 Solyc05g053850 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 DNA; 토마토 Solyc01g066980 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 DNA; 및 토마토 Solyc02g089160 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 DNA;를 포함하는, 줄기마디 길이가 감소되고 개화시기가 촉진된 토마토 식물체의 제조를 위한 유전자 교정용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Solyc06g074350 유전자의 표적 염기서열은 서열번호 5 및 6의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 Solyc05g053850 유전자의 표적 염기서열은 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 Solyc01g066980 유전자의 표적 염기서열은 서열번호 9 및 10의 염기서열로 이루어진 것이며, 상기 Solyc02g089160 유전자의 표적 염기서열은 서열번호 11 및 12의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 유전자 교정용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 교정용 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 토마토 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 줄기마디 길이가 감소되고 개화시기가 촉진된 유전자 교정 토마토 식물체의 제조방법.
  5. 제4항에 따른 방법에 의해 제조된 줄기마디 길이가 감소되고 개화시기가 촉진된 유전체 교정 토마토 식물체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 유전체 교정 토마토 식물체는 식물공장 또는 수직농업에 이용되는 것을 특징으로 하는 유전체 교정 토마토 식물체.
  7. 제5항에 따른 식물체의 유전체가 교정된 종자.
  8. 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함하는, 토마토 식물체의 줄기마디 길이 또는 개화시기 관련 유전자형의 판별을 위한 프라이머 세트 조성물.
  9. 제8항의 프라이머 세트 조성물 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 토마토 식물체의 줄기마디 길이 또는 개화시기 관련 유전자형의 판별을 위한 키트.
  10. 제9항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 완충용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  11. 토마토 식물 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제8항의 프라이머 세트 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 토마토 식물체의 줄기마디 길이 또는 개화시기 관련 유전자형의 판별방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 판별방법.

Description

토마토의 Micro-Tom 초형화 육종을 위한 유전자 편집 도구 및 분자마커{Gene-editing tool for breeding tomato with Micro-Tom-like architecture and molecular marker for the same} 본 발명은 토마토의 Micro-Tom 초형화 육종을 위한 유전자 편집 도구 및 분자마커에 관한 것이다. 스마트팜(Plant Factory 혹은 Vertical Farm)은 "통제된 일정한 시설 내에서 빛, 온도, 습도 등 작물의 생육환경조건을 인공적으로 제어해, 계절이나 장소에 관계없이 자동적으로 농작물을 연속 재배하는 시스템"을 의미한다. 계속해서 변화가 심해지는 기후 변화에 대응하고, 국내에서 생산 불가능했던 농작물의 재배를 가능케 하는 스마트팜은 미래 첨단농업기술을 접목하여 식물공장과 수직농업과 같은 스마트 농업으로 범위를 확장하고 있다. 중소벤처기업부에 따르면, 글로벌 스마트팜의 시장 규모는 22년 기준 약 449조원에 달한다. 반면, 국내 스마트팜 시장 규모는 22년 기준 약 5.9조원에 불과하며, 향후 국내에서 은퇴 이후 귀농을 희망하는 인구 수를 고려할 때 잠재적인 성장 여력도 충분해 보인다. 미래 스마트 농업은 공간과 시간을 효과적으로 활용할 수 있는 작물자원을 요구하고 있으며, 본 발명자는 웰빙 작물인 토마토를 대상으로 수직농업과 식물공장의 제한된 공간에 적합한 초형(草型)의 자원을 개발하고자, 토마토 'Micro-Tom' 품종의 초형과 관련된 변이인자를 연구하였다. 한편, 미국공개특허 제2024-0084320호에는 CRISPR을 이용한 'Compositions and methods for altering stem length in solanaceae'이 개시되어 있고, 미국공개특허 제2020-0299706호에는 'Mutations in MADS-box genes and uses thereof'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '토마토의 Micro-Tom 초형화 육종을 위한 유전자 편집 도구 및 분자마커'에 대해서는 기재된 바가 없다. 도 1은 Micro-Tom 초형 결정 변이들이 M82에 도입되는 과정과 mnt 및 eb-D 맵핑을 위한 맵핑 모집단의 준비 과정을 단순화한 도면으로, 품종 M82에 mnt(왼쪽) 및 eb-D(오른쪽) 변이체를 도입하기 위해 교배를 설계했으며, 솔라눔 핌피넬리포리움(Solanum pimpinellifolium, 토마토의 야생 조상)을 mnt 및 eb-D와 교배한 후, mnt 및 eb-D의 맵핑 개체군 생산을 위해 자가교배를 수행하였다(가운데). 괄호는 유전자형을 나타낸다. 도 2는 Micro-Tom에서 M82로 도입된 돌연변이 식물체의 표현형 사진으로, (A)는 야생형(WT), (B)는 왜소성(d), (C)는 eb-D, (D)는 mnt 돌연변이 식물체의 대표적인 줄기성장 및 개화시기를 보여준다. 빨간색 화살표는 주 줄기의 마디를 나타내며, 잎의 개화시기를 간접적으로 나타내는 잎의 개수(LPSM)는 일차줄기(원줄기) 분열조직에서 생성된 잎의 개화시기를 나타낸다. 눈금 막대: 2 cm. 도 3은 Mapping by sequence를 이용한 mnt 돌연변이 클로닝 결과로, (A)는 1번 염색체에서 62 Mbp 간격으로 mnt를 매핑한 것이다. mnt 맵핑 집단과 대조 집단 간의 SNP 지수(deltaSNPi)의 차이를 전체 염색체를 통해 플롯하였으며, 빨간색 점선은 게놈 전체에서 SNP 지수의 95% 컷오프를 나타낸다. 도 3(B)는 1번 염색체의 물리적 지도로, 빨간색 선은 mnt의 매핑 간격을 나타내고(위), 표는 그 간격에 있는 유전자의 mnt 돌연변이 후보를 요약한 것이다. 도 3(C)는 mnt 후보 돌연변이에서의 결실은 점선으로 표시된 1번 염색체 68,064~68,065 Kb 간격에 리드 깊이(read depth)가 거의 0인 부위는 Micro-Tom의 Solyc01g066980에서 결실을 나타낸다. mnt 결실에 대한 PCR 유전자형 분석을 수행하였고, 빨간색 화살표는 mnt의 유전자형 분석용 분자마커를 나타낸다. 도 4는 유전자 편집된 cr-mnt의 짧은 줄기 초형을 나타내는 표현형으로, (A)는 CRISPR/Cas9에 의한 돌연변이를 유도를 위해 사용한 Solyc01g066980 유전자의 가이드 RNA 표적 서열 위치(빨간색 화살표)를 보여주며, gRNA 표적과 PAM 서열은 각각 빨간색과 밑줄친 굵은 글씨로, 결실은 파란색 대시로 표시하였다. 괄호 안에 표시된 수치는 서열 간격 길이를 의미한다. 도 4(B)는 WT (sp sp5g인 Sweet100 double Determinate) 및 cr-mnt 식물체의 표현형으로, 옮겨심은 후 2개월 된 식물체의 이미지이며, 빨간색 화살촉은 첫 번째 꽃차례에서 가장 가까운 마디를 나타내며, 흰색 선 막대는 마디 길이를 나타낸다. 눈금 막대: 8 cm. 도 5는 Mapping by sequence를 이용한 eb-D 돌연변이 클로닝 결과로, (A)는 3번 염색체에서 50 Mbp 간격으로 eb-D를 맵핑한 것으로, eb-D 형질의 맵핑 집단과 대조군 집단의 SNP 지수(deltaSNPi)의 차이를 모든 염색체에 걸쳐 플롯하였으며, 빨간색 대시는 게놈 전체에서 SNP 지수의 95% 컷오프를 나타낸다. 도 5(B)는 3번 염색체의 물리적 지도이고, 빨간색 선은 eb-D의 매핑 간격을 나타내며(위), 표는 그 간격에 있는 유전자에 대한 eb-D 돌연변이 후보를 요약한 것이다(아래). 도 5(C)는 Fla.8924(해당 지역에 중복이 이미 알려진 품종, "duplication"로 표시) 및 Micro-Tom 게놈 시퀀싱 리드들이 전장유전체 위치(3번 염색체 58.5~59.6 Mb) 맵핑되는 리드 깊이를 나타낸다. 도 5(D)는 염색체 3번의 긴 팔에서 83 kb의 DNA 절편이 중복된 위치 및 구조를 보여주고(위), 정방향(F) 및 역방향(R) 프라이머의 PCR 마커를 사용하여 중복 여부를 확인한 결과이다(하단). 도 6은 유전자 가위로 편집된 cr-slful2 cr-slsbp6a의 개화지연 표현형으로, (A) 및 (B)는 CRISPR/Cas9에 의한 돌연변이를 유도를 위해 사용한 slful2 및 slsbp6a 유전자의 가이드 RNA 표적 서열 위치(빨간색 화살표)를 보여주며, gRNA 표적과 PAM 서열은 각각 빨간색과 밑줄친 굵은 글씨로, 결실은 파란색 대시로 표시하였다. 괄호 안에 표시된 수치는 서열 간격 길이를 의미한다. 도 6(C) 및 (D)는 WT (sp sp5g인 Sweet100 double Determinate) 및 cr-slful2 cr-slsbp6a 식물의 대표적인 식물 성장 및 개화시기를 나타낸 이미지로, 2개월 된 식물을 사용하였으며, 빨간색 화살촉은 첫 번째 꽃차례를 나타내며, 빨간색 선 막대는 마디 길이를 나타내며, 숫자는 마디사이에 발생된 잎의 수를 나타낸다. 눈금 막대: 4 cm. 도 7은 유전자 가위 기술로 편집해서 신규 육종한 Micro-sweet100의 모습이다. Sweet100 double Determinate(sp sp5g, 왼쪽)에 CRISPR/Cas9을 이용하여 d와 mnt 변이를 추가하여 sp sp5g cr-d cr-mnt 4중 돌연변이가 축적되도록 하였다. 본 발명은 토마토(Solanum lycopersicum) Solyc06g074350 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA (guide RNA) 또는 이를 암호화하는 DNA; 토마토 Solyc05g053850 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 DNA; 토마토 Solyc01g066980 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 DNA; 및 토마토 Solyc02g089160 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 DNA;를 포함하는, 줄기마디 길이가 감소되고 개화시기가 촉진된 토마토 식물체의 제조를 위한 유전자 교정용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 유전자 교정용 조성물은 바람직하게는 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산 서열을 더 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 유전자 교정용 조성물에 있어서, 상기 Solyc06g074350, Solyc05g053850, Solyc01g066980 및 Solyc02g089160 유전자는 차례대로 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1 내지 4의 염기서열과 각각 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 본 발명의 유전자 교정용 조성물에 있어서, 상기 Solyc06g074350, Solyc05g053850, Solyc01g066980 및 Solyc02g089160 유전자는 각각 토마토에서 sp (self pruning), sp5g (self pruning 5g), mnt (miniature) 및 d (dwarf) 변이와 관련된 유전자로, sp는 토마토 줄기의 유한생장을 유도하는 돌연변이이고, sp5g는 개화시기를 빠르게 해주는 돌연변이이고, mnt는 줄기마디 길이가 짧아지는 돌연변이이며, d는 초장이 왜소해지는 돌연변이이다. 본 명세서에서 용어 "유전체/유전자 교정(genome/gene editing)"은, 인간 세포를 비롯한 동·식물 세포의 유전체 염기서열에 표적지향형 변이를 도입할 수 있는 기술로서, DNA 절단에 의한 하나 이상의 핵산 분자의 결실(deletion), 삽입(insertion), 치환(substitutions) 등에 의하여 특정 유전자를 녹-아웃(knock-out) 또는 녹-인(knock-in)하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코