Search

KR-20260060504-A - THYMUS DERIVED PEPTIDE DERIVATIVES FOR PREVENTING HAIR LOSS OR PROMOTING HAIR GROWTH AND USE THEREOF

KR20260060504AKR 20260060504 AKR20260060504 AKR 20260060504AKR-20260060504-A

Abstract

본 발명은 탈모 예방 또는 발모 촉진용 흉선 유래 펩타이드 유도체에 관한 것으로, 본 발명의 흉선 유래 펩타이드 유도체 제조용 발현 카세트, 발현 벡터 및 이를 포함하는 형질전환체를 이용하면, 적은 비용으로 고순도의 흉선 유래 펩타이드 유도체를 대량으로 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 제조된 흉선 유래 펩타이드 유도체는 탈모 예방 효과가 뛰어나므로, 관련 용도의 화장품 소재, 의약외품 및 의약품 등 산업 전반에 널리 이용될 수 있다.

Inventors

  • 유병조

Assignees

  • 주식회사 비제이와이
  • 한국생산기술연구원

Dates

Publication Date
20260506
Application Date
20241024

Claims (7)

  1. 흉선 유래 펩타이드 유도체를 코딩하는, 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 대장균에서 발현될 수 있는 프로모터 서열 및 서열번호 15로 표시되는 fusion partner BJ002 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는, 흉선 유래 펩타이드 유도체 제조용 발현 벡터.
  2. 제1항의 발현 벡터를 포함하는 형질전환체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 형질전환체는 에쉬리키아( Escherichia ), 피치아( Pichia ), 사카로마이세스( Saccharomyces ), 자이고사카로마이세스( Zygosaccharomyces ), 클루베로마이세스( Kluyveromyces ), 칸디다( Candida ), 스키조사카로마이세스( Schizosaccharomyces ), 이자켄키아( Issachenkia ), 야로이야( Yarrowia ) 및 한세뉼라( Hansenula ) 속 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 형질전환체.
  4. 제2항의 형질전환체를 배양하는 단계; 및 배양된 형질전환체로부터 발현된 펩타이드를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 흉선 유래 펩타이드 유도체의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 분리 및 정제하는 단계는 멀티머(multimer) 흉선 유래 펩타이드 유도체가 포함된 용액의 가열 온도와 pH를 조절하거나, 및/또는 염침전하여 멀티머 흉선 유래 펩타이드 유도체를 모노머(monomer) 흉선 유래 펩타이드 유도체로 절단(cleavage)하여 수행되는 것인, 흉선 유래 펩타이드 유도체의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 염침전은 멀티머 흉선 유래 펩타이드 유도체가 포함된 용액에 황산암모늄을 첨가하여 침전물을 회수하는 방법으로 수행되는 것인, 흉선 유래 펩타이드 유도체의 제조방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 멀티머 흉선 유래 펩타이드 유도체는 Thymulin 유도체, Thymosin α1 유도체, 및 Thymosin β4 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이 조합된 것이고, 상기 모노머 흉선 유래 펩타이드 유도체는 Thymulin 유도체, Thymosin α1 유도체, 및 Thymosin β4 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것인, 흉선 유래 펩타이드 유도체의 제조방법.

Description

탈모 예방 또는 발모 촉진용 흉선 유래 펩타이드 유도체 및 이의 이용{THYMUS DERIVED PEPTIDE DERIVATIVES FOR PREVENTING HAIR LOSS OR PROMOTING HAIR GROWTH AND USE THEREOF} 본 발명은 탈모 예방 또는 발모 촉진용 흉선 유래 펩타이드 유도체 및 이의 이용에 관한 것이다. 최근 들어 중년 남성들의 전유물로 여겨져 왔던 탈모가 현대사회에서는 학업, 취직, 치열한 경쟁, 미래에 대한 불확실성 등이 유발하는 스트레스와 강박관념 때문에 청소년을 비롯한 20대 젊은 사람들에게 나타나며 탈모 인구가 큰 폭으로 증가하는 추세이다. 국내 탈모 인구는 2018년 기준 약 1,000만 명 이상이며, 2012년부터 2016년까지 탈모 치료를 받은 환자 약 103만 명 중 20대 탈모 환자가 전체의 20%인 21만 명으로 매년 약 22~25만 명의 탈모 환자가 치료를 받고 있다. 최근 탈모로 고민하는 인구 중 여성이 50% 이상으로 추산되며, 여성 탈모의 경우 다이어트에 대한 강박관념으로 영양 부족 상태가 심각하며 염색, 펌, 드라이 등이 주요한 원인으로 자리 잡고 있다. 탈모 환자들은 탈모로 인한 우울증, 수치심 등으로 인한 스트레스 강도가 높아지며 대인 또는 이성관계에 어려움을 겪는 등 사회적, 정서적으로 장애를 겪고 있다. 탈모 방지 및 발모 촉진 관련 유기 및 무기 소재, 오일, 천연 추출물, 항균물질 및 펩타이드 등 다양한 기능성 물질들이 개발되고 있다. 특히, 인체 흉선(Thymus)에서 분비되는 다양한 호르몬 중 탈모 관련 펩타이드들이 규명되었는데, Thymulin, Thymosin α1, β4 펩타이드들이 연구되고 있다. 티모신(Thymosin)은 28개의 아미노산으로 이루어진 thymosin α1, 43개의 아미노산으로 이루어진 thymosin β4 및 9개 아미노산의 티뮬린(Thymulin)이 주성분으로, 기존의 어린 송아지를 도축하여 흉선으로부터 얻는 방법 대신 경제적으로 고효율로 제조할 수 있는 기술 개발이 필요하다. 도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 DNA cassette 모식도이다. 도 2a 내지 도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 벡터맵으로, 도 2a는 BJYT000, 도 2b는 BJYT001, 도 2c는 BJYT002 벡터맵이다. 도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 흉선 유래 펩타이드 유도체 생산용 균주에서 생산된 단백질 발현양을 확인한 도이다 도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 흉선 유래 펩타이드 유도체 생산용 균주의 flask 테스트를 위한 TB, M9의 배지 조성을 나타낸 도이다. 도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 흉선 유래 펩타이드 유도체 생산용 균주의 flask 배양 결과를 나타낸 도이다. 도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 흉선 유래 펩타이드 유도체 생산용 균주의 5L 유가식 배양을 위한 TB, M9의 배지 조성을 나타낸 도이다. 도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작된 흉선 유래 펩타이드 유도체 생산용 균주의 5L 유가식 배양 결과를 나타낸 도이다. 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 생산된 흉선 유래 펩타이드 유도체의 분리·정제 결과를 확인한 도이다. 도 7a 내지 도 7c는 본 발명의 일 실시예에 따라 생산된 흉선 유래 펩타이드 유도체의 HPLC 분석 결과로, 도 7a는 각 유도체 3종의 표준품 HPLC 분석 결과(Thymulin(black), Thymosin α1(blue), Thymosin β4(green))이고, 도 7b는 포름산 처리 전 멀티머 상태의 펩타이드의 HPLC 분석 결과이고, 도 7c는 포름산 농도별(30, 50, 70%) 처리 후 HPLC 분석 결과이다. 이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 제조예. 흉선 유래 펩타이드 유도체 펩타이드의 제조 합성한 펩타이드(multimer) 및 타겟 펩타이드(Thymulin, Thymulin 유도체, Thymosin α1, Thymosin α1 유도체, Thymosin β4, Thymosin β4 유도체)는 하기 표 1에 나타내었다. 펩타이드 서열서열번호명칭서열(5'-3')1multimer(2:2:2)PEAKSQGGSNDPSDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGESDPSDAAVDYSSEITTKDLKEKKEVVEEAENDPEAKSQGGSNDPSDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGESDPSDAAVDYSSEITTKDLKEKKEVVEEAEND2ThymulinEAKSQGGSN3Thymulin 유도체PEAKSQGGSND4Thymosin α1SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN5Thymosin α1 유도체PSDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEND6Thymosin β4SDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGES7Thymosin β4 유도체PSDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGESD 1) 균주, DNA 카세트, 벡터 Gene work를 통하여 DNA 카세트를 제조하고(도 1 및 하기 표 2 참조), 이를 포함하는 벡터(도 2a 내지 2c 참조)를 E. coli 균주에 도입(형질주입)하여 형질전환체를 제작하였다. 먼저, 추가된 fusion partner 없이 흉선 유래 펩타이드 유도체 multimer(Thymulin 유도체, Thymosin β4 유도체, Thymosin α1 유도체 순으로 2 copy)를 삽입하였다(BJYT000). 구체적으로, 백본(backbone)이 되는 벡터(도 2a 참조)에 172 개의 흉선 유래 펩타이드 유도체 multimer 서열을 NdeI과 XhoI 효소를 활용하여 in-fusion 방법으로 삽입한 뒤 transformation하여 LBK plate로 selection하여 균주(대장균)를 제작하였다. 그 후 colony PCR을 통해 제작된 균주 서열(서열번호 8)을 확인하였다. 사용된 primer: Forward(taagaaggagatatacatatg, 서열번호 9), Reverse(gtggtggtgctcgagtta, 서열번호 10) 다음으로, 172 개의 흉선 유래 펩타이드 유도체 multimer 서열 앞에 스크리닝을 통해 선정된 112개의 Fusion partner 서열을 추가하여 균주를 제작하였다(BJYT001). 구체적으로, 백본이 되는 벡터(도 2b 참조)에 112개의 fusion partner BJ001(MNIRPLHDRVIVKRKEVETKSAGGIVLTGSAAAKSTRGEVLAVGNGRILENGEVKPLDVKVGDIVIFNDGYGVKSEKIDNEEVLIMSESDILAIVEAHHHHHHENLYFQHMD, 서열번호 11) 서열을 NdeI 효소를 활용하여 in-fusion 방법으로 삽입한 뒤 transformation하여 LBK plate로 selection하여 균주(대장균)를 제작하였다. 그 후 colony PCR을 통해 제작된 균주 서열(서열번호 12)을 확인하였다. 사용된 primer: Forward(taagaaggagatatacatatg, 서열번호 13), Reverse(tttcgcttccggatccatatgctggaaatacaggttttcgtg, 서열번호 14) 끝으로, 172 개의 흉선 유래 펩타이드 유도체 multimer 서열 앞에 스크리닝을 통해 선정된 11개의 Fusion partner 서열을 추가하여 균주를 제작하였다(BJYT002). 구체적으로, 백본이 되는 벡터(도 2c 참조)에 11개의 fusion partner BJ002(MNIRPLHPWMD, 서열번호 15) 서열을 DpnI & NcoI 효소를 활용하여 in-fusion 방법으로 삽입한 뒤 transformation하여 LBK plate로 selection하여 균주(대장균)를 제작하였다. 그 후 colony PCR을 통해 제작된 균주 서열(서열번호 16)을 확인하였다. 사용된 primer: Forward(aatccatggcatcatcatcaccaatccatggca, 서열번호 17), Reverse(gtgccatggatgcaatggacgaatattcatatg, 서열번호 18) 제작된 각 균주에 의해 생산된 단백질의 발현량을 확인하였다. 구체적으로, 전처리 과정(cell lysis -> 원심분리 -> pH 침전)을 통하여 분리된 불용성 분획을 5x SDS sample buffer에 희석하여 95℃에서 10분간 가열하였다. 그 다음, 4~12% gradient gel(Invitrogen)을 사용하여 전기영동을 실시하였다. 크기별로 분리된 단백질을 쿠마시블루로 염색하고, 증류수로 세척하여 염색된 단백질을 확인하였다. 그 결과, 도 3에서 확인할 수 있듯이, 11개의 fusion partner를 붙여 제작된 BJYT002 균주의 발현양이 가장 높은 것을 알 수 있었다. 따라서 이후의 균주 최적화, 분리/정제 공정 개발을 BJYT002 균주로 시행하였다. 플라스미드 서열 참고서열(5'-3')Trc PromoterAGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAT(서열번호 19)Lac operatorAATTGTGAGCGGATAACAATT(서열번호 20)RBSAGGAGGHis-tagHHHHHHTEV protease siteENLYFQGFusion partner BJ002MNIRPLHPWMD(서열번호 15)TTT DP-2XPEAKSQGGSNDPSDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGESDPSDAAVDYSSEITTKDLKEKKEVVEEAENDPEAKSQGGSNDPSDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGESDPSDAAVDYSSEITTKDLKEKKEVVEEAEND(서열번호 1)T7 terminator CTCGCTGAGTTAATTAA(서열번호