KR-20260060511-A - UT2 gene knockout erythroid progenitor cells and, methods of erythroid differentiation thereof

Abstract

본 발명은 UT2 유전자 결손 적혈구 전구세포 및 이의 적혈구 분화 방법에 관한 것으로, 적혈구 전구세포에서 UT2 유전자를 knock out한 UT2 유전자 결손 세포는 본 발명에 따른 적혈구 분화 조건에서 적혈구 분화 마커가 더 높은 비율로 발현되고, 적혈구 분화가 더 빠르게 진행되는 것으로 확인됨에 따라, UT2 유전자 결손 적혈구 전구세포를 이용하여 적혈구를 빠르게 분화할 수 있는 방법을 제공한다.

Inventors

• 이동준
• 김지원
• 배희은
• 최희선

Assignees

• 부산대학교 산학협력단

Dates

Publication Date

20260506

Application Date

20241024

Claims (9)

1. 시험관 내( in vitro )에서 적혈구 전구 세포에서 UT2(urea transporter 2) 유전자를 결손(knock out)시키는 단계; 및 상기 UT2 유전자가 결손된 적혈구 전구 세포를 적혈구 분화 배지에서 배양하여 적혈구 전구 세포를 적혈구로 분화하는 단계;를 포함하는 적혈구 분화 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 적혈구 전구 세포는 SCF(stem cell factor), EPO(erythropoietin), DOX(doxycycline), 및 DEX(dexamethasone)를 포함하는 배지에서 배양되는 것을 특징으로 하는, 적혈구 분화 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 UT2 유전자를 결손시키는 단계는, sgRNA를 이용한 CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 시스템으로 서열번호 1로 표시되는 UT2 유전자(Genebank ID : NC_000014.9)를 knock out 시키는 것을 특징으로 하는, 적혈구 분화 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 UT2 sgRNA는 렌티바이러스(lentivirus)를 통해 적혈구 전구 세포에 도입되는 것을 특징으로 하는, 적혈구 분화 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 UT2 유전자가 결손된 적혈구 전구 세포는 퓨로마이신(puromycin)을 포함하는 배지에서 선별되는 것을 특징으로 하는, 적혈구 분화 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 UT2 유전자를 결손시키는 단계는, 상기 적혈구 전구 세포에 서열번호 1로 표시되는 UT2 유전자에 상보적으로 결합하는 sgRNA를 포함하는 렌티바이러스(lentivirus) 첨가하고 24시간 내지 48 시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는, 적혈구 분화 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 적혈구로 분화하는 단계는, 상기 UT2 유전자가 결손된 적혈구 전구 세포를 EPO(erythropoietin), 인슐린(insuline), 트랜스페린(transferrin), DOX(doxycycline), 및 SCF(stem cell factor)을 포함하는 제1차 분화 배지에서 4일 동안 배양하는 단계; 상기 UT2 유전자가 결손된 적혈구 전구 세포를 EPO(erythropoietin), 인슐린(insuline), 트랜스페린(transferrin), 및 DOX(doxycycline)을 포함하는 제2차 분화 배지에서 3일 동안 배양하는 단계; 및 상기 UT2 유전자가 결손된 적혈구 전구 세포를 EPO(erythropoietin), 인슐린(insuline), 및 트랜스페린(transferrin)을 포함하는 제2차 분화 배지에서 배양하는 단계;로 이루어진 것을 특징으로 하는, 적혈구 분화 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 적혈구 전구 세포를 적혈구로 분화하는 단계는 7일 내지 22일 이내에 완료되는 것을 특징으로 하는, 적혈구 분화 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법으로 분화된 적혈구.

Description

UT2 유전자 결손 적혈구 전구세포 및 이의 적혈구 분화 방법{UT2 gene knockout erythroid progenitor cells and, methods of erythroid differentiation thereof} 본 발명은 UT2 유전자 결손 적혈구 전구세포 및 이의 적혈구 분화 방법에 관한 것이다. 적혈구는 혈액의 세포 성분인 혈구의 대부분을 차지하는 세포로 혈구 전체의 44%를 차지하며, 주로 산소를 운반하는 기능을 수행한다. 적혈구는 조혈모세포로부터 여러 분화 단계를 거쳐 만들어지는데, 버스트 형성 단위 적혈구 (burst forming unit erythroid, BFU-E), 콜로니 형성 단위 적혈구 (colony forming unit erythroid, CFU-E), 전적아구(proerythroblast), 호염기성 적아구 (basophilic erythroblast), 다염성 적아구 (polychromatic erythroblast), 정염성 적아구 (orthochromatic erythroblast)를 거쳐 핵이 점차 응축되며 세포의 크기가 작아진다. 응축된 핵이 탈핵된 후 망상적혈구 (reticulocyte)가 되고, 여기에 잔존해 있던 RNA 및 소기관(microorganelles)dl 없어지고 양쪽이 오목한 형태(biconcave shape)가 되면 성숙한 적혈구 (erythrocyte, RBC)가 된다. 이 분화과정은 일반적으로 인 비트로에서는 3주 동안 진행되며 성숙한 적아구인 다염성 적아구 단계 이후로는 세포의 증식이 한정적이다. 적혈구는 출혈과 같은 응급 상황이나 암, 혈액 및 수술과 같은 병릭학적 의료학적 조건에서 필수적으로 필요하다. 전 세계적으로 수혈을 통해 적혈구가 수집되고 있지만, 적합한 조건의 적혈구가 수혈되는 데에는 한계가 있으며, 혈액을 수집 및 운반하는 과정에서 병원균 및 바이러스에 오염되는 등의 문제가 발생됨에 따라 안전한 혈액을 제공하기 위한 다양한 시도가 개발되고 있다. 그중 하나가 인공 혈액을 제작하는 것이며, 인공 혈액의 기조는 시험관 내에서 적혈구를 생산하는 것이다. 적혈구를 시험관내(in vitro)에서 생산하는 방법은 조절 줄기 세포의 분화 배지를 이용하는 방법이 알려져 있다. 그러나 현재의 방법은 대규모 생산하기에 결정적인 결합이 있으며, 적혈구 세포의 성숙이 적합하게 진행되지 않는 문제가 있다. 도 1은 CRISPR-Cas9 시스템을 이용하여 적혈구 전구 세포에서 UT2 유전자 결손 세포주를 확립하기 위한 실험 도식이다. 도 2는 본 발명에 따라 확립된 UT2 유전자 결손 세포에서 UT2 유전자의 결손 여부를 T7E1(T7 Endonuclease 1) 검출 방법으로 분석한 결과이다. 도 3은 본 발명에 따라 확립된 UT2 유전자 결손 적혈구 전구 세포를 적혈구로 분화시키기 위한 실험 도식이다. 도 4는 본 발명에 따라 확립된 UT2 유전자 결손 적혈구 전구 세포를 적혈구로 분화한 후 적혈구 분화 마커의 발현 수준의 변화를 분석한 결과이다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다. 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다. 이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 본 발명은 시험관 내(in vitro)에서 적혈구 전구 세포에서 UT2(urea transporter 2) 유전자를 결손(knock out)시키는 단계; 및 상기 UT2 유전자가 결손된 적혈구 전구 세포를 적혈구 분화 배지에서 배양하여 적혈구 전구 세포를 적혈구로 분화하는 단계;를 포함하는 적혈구 분화 방법을 제공한다. 상기 전구 세포(progenitor cell)는 자기 복제능 및 분화능을 가진 미분화 세포이지만, 최종적으로 분화하는 세포의 종류가 이미 결정되어 있는 궁극적으로 분화된 세포이다. 상기 적혈구 전구 세포(erythroid precursor cell)는 성숙이 끝난 적혈구를 제외한 적혈구 형성 과정에 포함된 모든 세포를 의미한다. 구체적으로 상기 적혈구 전구 세포는 탈핵 전의 적혈구계 세포(erythroid cell)를 지칭하는 것일 수 있으며, 미성숙 적혈구 전구세포나 적혈구 계열 특이적인 분자인 글리코포린 A(Glycophorin A) 양성의 탈핵전의 세포일 수 있다. 예를 들어, 상기 적혈구 전구세포는 전적아구(proerythroblast), 호염기성 적아구 (basophilic erythroblast), 다염성 적아구(polychromatic erythroblast), 및 정염성 적아구(orthochromatic erythroblast)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 적혈구 전구 세포는 SCF(stem cell factor), EPO(erythropoietin), DOX(doxycycline), 및 DEX(dexamethasone)를 포함하는 배지에서 배양된다. 상기 UT2 유전자를 결손시키는 단계는 sgRNA를 이용한 CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 시스템으로 서열번호 1로 표시되는 UT2 유전자(Genebank ID : NC_000014.9)를 knock out 시키는 것이며, 상기 UT2 sgRNA는 렌티바이러스(lentivirus)를 통해 적혈구 전구 세포에 도입된다. 상기 UT2 유전자가 결손된 적혈구 전구 세포는 퓨로마이신(puromycin)을 포함하는 배지에서 선별된다. 상기 UT2 유전자를 결손시키는 단계에서 상기 적혈구 전구 세포에 서열번호 1로 표시되는 UT2 유전자에 상보적으로 결합하는 sgRNA를 포함하는 렌티바이러스(lentivirus) 첨가하고 24시간 내지 48 시간 동안 배양한다. 상기 적혈구로 분화하는 단계는 상기 UT2 유전자가 결손된 적혈구 전구 세포를 EPO(erythropoietin), 인슐린(insuline), 트랜스페린(transferrin), DOX(doxycycline), 및 SCF(stem cell factor)을 포함하는 제1차 분화 배지에서 4일 동안 배양하는 단계; 상기 UT2 유전자가 결손된 적혈구 전구 세포를 EPO(erythropoietin), 인슐린(insuline), 트랜스페린(transferrin), 및 DOX(doxycycline)을 포함하는 제2차 분화 배지에서 3일 동안 배양하는 단계; 및 상기 UT2 유전자가 결손된 적혈구 전구 세포를 EPO(erythropoietin), 인슐린(insuline), 및 트랜스페린(transferrin)을 포함하는 제2차 분화 배지에서 배양하는 단계;로 이루어진다. 상기 적혈구 전구 세포를 적혈구로 분화하는 단계는 7일 내지 22일 이내에 완료된다. 또한, 상기 방법에 따라 분화된 적혈구를 제공한다. 이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실험예 및 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실험예 및 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실험예 및 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다. [실시예 1] UT2 유전자 결손 세포 확립 적혈구 분화에서 UT2(urea transporter 2) 유전자의 역할을 확인하기 위해서 CRISPR-Cas9 시스템을 이용하여 인간 적혈구 전구 세포주인 HUDEP-2 세포에서 UT2 유전자 결손 세포주를 도 1과 같은 방법으로 확립하였다. HUDEP-2 세포는 0.4 μg/ml 덱사메타손(dexamethasone)(DEX)(Sigma), 1 μg/ml 독시사이클린(doxycycline)(DOX)(Clontech), 50 ng/ml SCF(stem cell factor)(R&D systems), 및 5 ng/ml EPO(erythropoietin)(Peprotech)을 포함하는 Stemspan SFEM(StemspanTM Serum-Free Expansion Medium)(STEM CELL technologies) 배지에서 배양되었다. 사이토카인이 포함된 배지에서 키운 HUDEP-2 세포에 UT2 유전자를 knock out 시키기 위해 UT2 sgRNA 렌티바이러스(lentivirus)를 이용한 스핀 감염(spin infection) 방법으로 HUDEP-2 세포를 형질 전환하였다. 사이토카인이 포함된 Stemspan SFEM 배지에 바이러스 감염에 도움을 주는 화학물질인 폴리브렌(polybrene)(Santacruz) 0.8 μg/ml을 첨가한 후, 상기 배지 2 mL에 1 X 106 개의 HUDEP-2 세포를 현탁 시켰다. 6 well plate에 분주한 후 UT2 sgRNA (sc-414550-ACT, Santa Cruz)를 포함하는 2 X 106 TU/ml의 렌티바이러스(lentivirus)를 1 mL를 첨가하였다. 20℃, 2,000 rpm 조건으로 90분 동안 원심분리 하였다. 24 시간 후 폴리브렌이 포함된 새 세포 배양 배지 2 mL에 세포를 재현탁 시키고, UT2 sgRNA 렌티바이러스 1 mL을 첨가하고, 한 번 더 원심분리 하였다. 24 시간 후 사이토카인이 포함된 Stemspan SFEM 배지로 교체하였다. 24 시간 동안 배양한 후, 0.5 μ